大米α-球蛋白功能肽段的血管细胞保护机制研究

摘要

近年来大米蛋白改善慢性病的功效逐渐获得研究证实，如抗糖尿病，抗高血压，抗动脉粥样硬化(AS)等。球蛋白是大米蛋白中最主要的生物活性蛋白，大米球蛋白中的绝大部分为α-球蛋白。实验室前期研究证实了大米α-球蛋白（100mg/kg体重/天）的抗AS作用，但其在体内经胃肠道消化后能够被吸收并发挥功效的关键肽段尚不明确。在大米α-球蛋白的抗AS机制研究中，本实验室前期研究已排除了调节脂质代谢紊乱的途径，是否通过另一个主要途径，即血管细胞保护作用发挥功效仍有待于进一步研究。因此，本论文从大米α-球蛋白肽段的制备及其血管细胞保护作用开展研究，旨在进一步揭示大米α-球蛋白的抗AS作用机制。
　　首先，利用G-15葡聚糖凝胶色谱和半制备高效液相色谱分离纯化大米α-球蛋白体外消化产物中可吸收组分，得到11个主要组分峰;经液相一串联质谱测定氨基酸序列，二级质谱结果通过比对Uniprot数据库，鉴定出5条目标肽段(YYGGEGSSSEQG、GEQQQQPGM、YGEGSSEEG、AAGALPS、SESEM)，并利用固相合成技术获得纯度达到97％的5个目标肽段。由动物实验验证目标肽的可吸收性，以10mg/kg体重/天的剂量灌胃金黄地鼠，4小时后取血，考察其血清中目标肽的存在，离子阱质谱结果显示，血清中可检测到全部5条目标肽，证实目标肽段均可直接被机体吸收。
　　其次，研究了5个目标肽对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的血管内皮细胞损伤的影响。通过研究不同处理浓度和时间的TNF-α对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤程度，确定了10ng/mL的TNF-α处理6小时来构建内皮细胞损伤模型。在此基础上运用50μg/mL的目标肽预处理细胞18小时，测定了细胞的氧化应激和炎症反应。结果显示肽可以显著缓解细胞损伤引起的活性下降，降低细胞凋亡率，并有效调节炎症因子(NO，iNOS)及细胞粘附因子的水平（ICAM-1，VCAM-1），且对氧化应激因子(MDA，GSH-Px和SOD)水平有改善作用。进一步分析了核因子-κB(NF-κB)的核转运，以及上下游信号因子（IKKα、IκBα、Bcl-2、Bax、p-p38）的表达水平，结果显示肽通过抑制p65和p38信号通路调节黏附分子表达和抑制内皮细胞凋亡。细胞活力实验和平板划痕实验结果表明，肽YYGGEGSSSEQG、SESEM可有效抑制血管平滑肌细胞(VSMC)的异常增殖和迁移。同时，目标肽表现出可下调血小板衍生生长因子(PDGF-BB)的功效，这可能是其抑制VSMC增值迁移的关键原因。
　　最后，为进一步验证大米α-球蛋白肽基于血管细胞保护的抗AS功效，选取目标肽YYGGEGSSSEQG、SESEM（10mg/kg体重/天）灌胃载脂蛋白E基因敲除（Ap oE-/-）小鼠三个月。主动脉染色切片结果显示，这2条目标肽均可显著减小ApoE-/-小鼠主动脉的AS斑块面积;血清检测结果表明，目标肽可显著降低ApoE-/-小鼠血清GSH-Px、SOD、CAT等抗氧化酶水平以及VCAM-1水平，但对血清和肝脏的脂质水平没有明显作用。
　　利用分离鉴定及生物合成法获得纯化的α-球蛋白肽段，经体内、体外实验，证实其通过修复TNF-α引起的HUVEC损伤、抑制VSMC增殖和迁移的血管细胞保护作用，以及由此所发挥的抗AS机制。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 大米蛋白的营养与功能

1．1．1 大米蛋白的营养成分

1．2．1 食物蛋白的消化吸收特性

1．2．2 食源性肽的功能活性

1．2．3 食源性肽的分离纯化与鉴定

1．3 血管细胞的生理功能与保护

1．3．1 血管细胞功能紊乱与动脉粥样硬化

1．3．2 食源肽的血管细胞保护作用研究

1．4 立题意义和研究内容

1．4．1 立题意义

1．4．2 研究内容

第二章 大米α-球蛋白肽的分离鉴定与吸收验证

2．1 引言

2．2 材料

2．2．3 主要试剂

2．2．4 主要仪器

2．3 实验方法

2．3．4 大米α-球蛋白肽的体内吸收评价

2．4 结果与讨论

2．4．1 葡聚糖凝胶G-15层析分离混合肽

2．4．2 半制备高效液相色谱分离混合肽

2．4．3 液质谱分析组分结构

2．4．4 肽的体内吸收状况评价

2．5 本章小结

第三章 大米α-球蛋白肽的血管细胞保护作用研究

3．1 引言

3．2 材料

3．2．3 主要仪器

3．3 实验方法

3．3．1 细胞培养

3．3．5 Western Blot测定胞浆中VCAM-1和ICAM-1水平

3．3．8 数据处理

3．4 结果与讨论

3．4．2 肽对TNF-α诱导的HUVEC损伤的影响

3．4．3 肽对HUVEC中氧化应激水平的影响

3．4．4 肽对HUVEC的炎症因子的影响

3．4．5 TNF-α诱导VSMC增殖模型的建立

3．4．6 肽对TNF-α诱导的VSMC增殖的影响

3．4．7 肽对TNF-α诱导的VSMC迁移的影响

3．5 本章小结

第四章 大米α-球蛋白肽血管细胞保护作用的机制研究

4．1 引言

4．2 材料

4．2．1 细胞

4．2．2 主要试剂

4．2．3 主要仪器

4．3 实验方法

4．3．1 细胞培养

4．3．2 胞浆总蛋白的提取

4．3．3 核蛋白的提取

4．3．4 双荧光染色测定NF-κB核转位水平

4．4．1 肽对HUVEC中NF-κB p65蛋白的活化和核转位的影响

4．4．2 肽对HUVEC中NF-κB上游信号因子水平的影响

4．4．3 肽对HUVEC中细胞凋亡调控因子水平的影响

4．4．4 肽对VSMC中细胞增殖迁移调控因子水平的影响

4．5 本章小结

第五章 大米α-球蛋白肽的抗动脉粥样硬化功效评价

5．1 引言

5．2 材料

5．2．1 实验动物

5．2．2 主要试剂

5．2．3 主要仪器

5．3 实验方法

5．3．5 ELISA测定小鼠血清氧化应激因子与炎症因子水平

5．3．6 图像数据处理

5．4 结果与讨论

5．4．1 肽对ApoE-／-小鼠动脉粥样硬化斑块面积的影响

5．4．2 肽对ApoE-／-小鼠脂质代谢的影响

5．4．3 肽对ApoE-／-小鼠氧化应激与炎症因子水平的影响

5．5 本章小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

致谢

作者简历