黄曲霉毒素B1与M1对小鼠肠道的联合毒性作用机理

摘要

食品遭受霉菌毒素污染的现象在世界范围内普遍存在，不仅给农业生产带来巨大经济损失，还给人类健康带来威胁。在众多霉菌毒素中，黄曲霉毒素(aflatoxin，AF)是较常见且毒性较强的一类。在不同类型的黄曲霉毒素中，黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)是毒性最强的一种，主要污染谷物粮油类食品，黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1，AFM1)是AFB1的衍生物，主要污染奶及奶制品。肠道作为机体免疫系统的第一道重要防线，是机体抵御肠腔内细菌、内毒素等病原体以及营养型抗原、毒素等外来污染物进入血液循环和组织器官的重要黏膜屏障。这种屏障功能依赖于完整的肠道上皮层结构，以及稳定健康的肠道内微生物区系结构。肠道细胞作为霉菌毒素早期暴露的细胞，暴露剂量往往高于其他组织细胞;另外肠道细胞属于蛋白质合成及代谢周转率较高且活性较强的细胞，容易成为霉菌毒素攻击的靶细胞，因此在最近的研究报道中，肠道组织及其功能已经逐渐成为研究霉菌毒素毒性作用的新靶点。随着人们生活水平的提高，“牛奶+谷物”的饮食模式已逐步成为常见的家庭膳食模式，在这种模式下，AFB1与AFM1在人体内共存并产生交互作用的潜在风险增加，但是与AFB1或AFM1单独作用相比，AFB1与AFM1共存后对人体健康危害风险是否改变，AFB1与AFM1联合毒性作用发生的分子机制及调控网络是什么等问题未得到解答。
　　因此为了揭示AFB1与AFM1单独及联合作用对动物模型肠道健康的影响，解析毒性作用的蛋白组分子机理，筛选毒性作用靶蛋白开展本试验。本研究首先建立了单一剂量AFB1(03mg/kgb w)、单一剂量AFM1（30mg/kg b.w）及单一剂量AFB1与AFM1联合(0.3mg/kgb.w.AFB1+30mg/kgb.w AFM1)重复灌胃的ICR小鼠模型，并与灌胃毒素溶剂的小鼠做对照，每组10只小鼠，每天一次重复灌胃28天，期间记录小鼠健康状况及体增重。灌胃结束后处死小鼠，采集小鼠血液、肠道组织及肠道内容物。随后测定脏器指数，血液中的肠道损伤指标水平（血清中二胺氧化酶活性、D-乳酸含量、血清肠型脂肪酸结合蛋白含量及瓜氨酸含量），制作肠道组织切片观测小肠绒毛形态，检测肠道上皮细胞凋亡率，测定肠道杯状细胞数目，观测紧密连接蛋白定位变化规律;分析肠道内容物细菌群落结构变化规律，分析肠道组织蛋白质组变化规律，最后结合本试验结果及文献数据，探讨AFB1与AFM1单独及联合作用对小鼠肠道结构、细胞活力及其屏障功能的损伤途径，发掘AFB1与AFM1单独及联合作用对小鼠肠道细菌群落结构的改变规律，解析AFB1与AFM1单独及联合肠道毒性作用的分子机制。主要试验结果如下:
　　一，AFB1与AFM1联合灌胃组小鼠血液中瓜氨酸含量显著低于对照组及单独灌胃组(p＜005)。AFB1单独灌胃及其与AFM1联合灌胃组小鼠血液中二胺氧化酶活性显著高于AFM1单独灌胃组及对照组(p＜005)。AFM1单独灌胃组及其与AFB1联合灌胃组小鼠血液中肠型脂肪酸结合蛋白含量显著高于对照组(p＜005)，且AFB1与AFM1联合灌胃组显著高于AFM1单独灌胃组(p＜0.05);各处理组小鼠血液中D-乳酸含量均显著高于对照组(p＜005)，AFB1与AFM1联合灌胃组小鼠血液中D-乳酸含量显著高于单独灌胃组(p＜005)。与对照组相比，AFB1单独灌胃组小肠全段（十二指肠、空肠及回肠）的绒毛长度显著降低(p＜005)，AFM1单独灌胃组小肠中后段（空肠及回肠）绒毛长度显著降低(p＜005)，AFB1与AFM1联合灌胃组小肠全段的绒毛长度显著降低(p＜005)，且对中后段的影响程度大于两毒素单独作用。AFB1与AFM1单独及联合灌胃未影响十二指肠绒毛隐窝深度，但AFM1单独灌胃组及其与AFB1联合灌胃组小鼠小肠中后段绒毛隐窝深度显著提高(p＜005)。AFB1和AFM1单独及联合灌胃诱导小肠中后段细胞凋亡，且联合灌胃组细胞凋亡率明显高于单独灌胃组。AFB1和AFM1联合灌胃组结肠杯状细胞的数目显著降低(p＜005)。另外，AFB1和AFM1联合灌胃组小鼠肠道上皮细胞Occludin1蛋白在细胞顶膜及细胞侧面膜顶端区域的分布减少，而在细胞质的分布增多，ZO-1蛋白在细胞质内发生由顶侧像基底侧的分布移位。
　　二，在细菌群落的门水平、科水平及属水平，三个毒素处理组与对照组相比，小鼠肠道内容物细菌优势菌群均未发生明显排序变化，但不同的毒素处理，仍造成了不同分类水平下细菌菌群丰度的显著变化，其中AFB1灌胃组及其与AFM1联合灌胃组小鼠肠内致病菌或条件致病菌，如Facklamia属、Staphylococcus属、Corynebacterium属细菌丰度显著升高(p＜005)。而AFM1灌胃组未见显著差异。
　　三，(1)与对照组相比，AFB1与AFM1单独及联合灌胃组与小鼠肠道细胞活力，蛋白质转运，细胞形状及骨架调控，响应真菌及药物代谢等生物过程相关的蛋白质丰度差异表达，且联合灌胃组相关差异表达蛋白质数量多于单独灌胃组。(2)与对照组相比，AFB1与AFM1单独及联合灌胃组小鼠肠道细胞凋亡信号通路，细胞癌变相关信号通路均被激活，且联合灌胃组更显著;此外，两毒素单独灌胃组相比及分别与联合灌胃组相比，差异表达蛋白质所富集的通路存在差异:AFB1单独灌胃组差异表达蛋白质主要富集在醚脂类代谢、磷酸肌醇代谢、甘油磷脂代谢、脂肪的消化和吸收等信号通路;AFM1单独灌胃组主要富集在蛋白质输出、病毒感染、内质网中的蛋白合成等信号通路;AFB1和AFM1联合灌胃组主要富集在补体和凝血级联、蛋白质输出、肿瘤坏死因子信号通路、IL-17信号通路、癌症MicroRNAs、药物代谢-细胞色素P450、MAPK等信号通路。(3)与单独灌胃组相比，两毒素联合灌胃组小鼠肠道细胞中负责解毒及代谢外来异物的蛋白质，如UDP-GT1、UDP-GT2、Gstm6等的表达量显著下调(p＜005)，细胞紧密连接结构相关蛋白质Claudin7及IQGAP2的表达量显著下调(p＜005)，细胞凋亡相关蛋白质MAP4K3表达量显著上调(p＜005)。
　　本试验的主要结论包括:AFB1与AFM1联合作用增强了两者单独作用对小鼠肠道细胞活力、紧密连接结构的损伤，导致肠道物理屏障功能受损;两毒素联合作用主要通过抑制肠道细胞对毒素及外来异物的代谢解毒通路活性，抑制肠道紧密连接结构相关蛋白质表达，以及激活细胞凋亡相关通路等机制增强肠道毒性，涉及的主要靶蛋白包括UDP-GT1、UDP-GT2、Gstm6、MAP4K3、Claudin7及IQGAP2。AFB1单独作用及其与AFM1联合作用诱导小鼠肠道内致病菌或条件致病菌，如Facklamia属、Staphylococcus属、Corynebacterium属细菌增殖，改变肠道内健康微生物区系，损伤肠道微生物屏障功能。
　　综上，本研究在动物模型上系统性验证了AFB1与AFM1对肠道细胞、肠道结构完整性及屏障功能的损伤毒性，并发现了AFB1与AFM1联合摄入后存在增强肠道毒性的风险，首次从蛋白质组学水平解析了AFB1与AFM1单独及联合损伤肠道结构与功能的分子机制，筛选了毒性作用靶蛋白。研究结论对于科学评估黄曲霉毒素联合作用的健康危害、防控新的食品安全隐患具有重要的科学意义。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 黄曲霉毒素概况

1．1．1 黄曲霉毒素B1与M1的产生

1．1．2 黄曲霉毒素B1与M1的理化性质及毒性

1．1．3 黄曲霉毒素B1与M1的致病性及致病机理

1．1．4 黄曲霉毒素B1与M1的暴露及联合摄入风险

1．2 黄曲霉毒素B1与M1的肠道毒性研究进展

1．2．1 肠道结构完整性及其屏障功能

1．2．2 黄曲霉毒素B1与M1对肠道结构完整性及其屏障功能的影响

1．3 组学技术在霉菌毒素毒理研究中的应用

1．4 本研究的目的与意义

1．5 本研究的技术路线

第二章 材料与方法

2．1．3 试验仪器

2．2 试验方法

2．2．1 小鼠灌胃实验及样品采集

2．2．2 体增重及脏器指数测定

2．2．3 血液生化指标测定及数据分析

2．2．4 肠道组织病理学观测

2．2．5 肠道内容物微生物多样性检测及分析

2．2．6 肠道组织蛋白质组学检测及分析

第三章 结果与分析

3．2 AFB1与AFM1单独及联合作用对小鼠血液中肠道损伤指标的影响

3．2．2 AFB1与AFM1单独及联合作用对小鼠血液中肠道上皮通透性指标的影响

3．3 AFB1与AFM1单独及联合作用对小鼠肠道上皮层完整性的影响

3．3．1 AFB1与AFM1单独及联合作用对小鼠肠道上皮绒毛形态的影响

3．3．2 AFB1与AFM1单独及联合作用对小鼠肠道上皮细胞凋亡的影响

3．3．3 AFB1与AFM1单独及联合作用对小鼠肠道杯状细胞数目的影响

3．3．4 AFB1与AFM1单独及联合作用对小鼠肠道紧密连接蛋白定位的影响

3．4 AFB1与AFM1单独及联合作用对小鼠肠道内容物微生物多样性的影响

3．4．1 样品DNA检测及物种注释与α多样性评估

3．4．2 各组内小鼠肠道内容物细菌群落组成分析

3．4．3 各组间小鼠肠道内容物细菌群落组成差异分析

3．4．4 各组间小鼠肠道内容物差异菌群筛选

3．5 AFB1与AFM1单独及联合作用对小鼠肠道蛋白质组的影响

3．5．1 不同处理组肠道差异表达蛋白质的筛选

3．5．2 不同处理组肠道差异表达蛋白质功能注释及富集

3．5．3 不同处理组肠道差异表达蛋白质KEGG信号通路富集

3．5．4 AFB1与AFM1联合处理增强肠道毒性的靶标蛋白质筛选

3．5．5 靶标蛋白质表达量验证

第四章 讨论

4．1．2 AFB1与AFM1单独及联合作用诱导小肠细胞凋亡，降低结肠杯状细胞数目

4．1．3 AFB1与AFM1单独及联合作用导致小肠绒毛萎缩

4．2 AFB1与AFM1联合作用诱导肠道致病菌增殖，损伤肠道生物屏障功能

4．3 AFB1与AFM1单独及联合肠道毒性作用机理

4．3．2 AFB1与AFM1联合作用增强肠道毒性的机理

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历