抗PEDV单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

摘要

猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)可引起猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)。PED为高度接触性肠道传染病，感染仔猪表现为发热、呕吐、脱水、严重腹泻等症状。PEDV具有4种结构蛋白，分别为纤突蛋白、膜糖蛋白、小膜蛋白和核衣壳(Nucleocapsid，N)蛋白。其中N蛋白是一个重要的结构蛋白，并且高度保守，常作为检测PEDV的目的蛋白。
　　本研究通过Vero C1008细胞繁殖本实验室内保存的PEDV CV777细胞适应株，随后通过梯度密度离心得到纯化PEDV，经SDS-PAGE和Western blot分析，PEDV纯化效果良好。将纯化后的PEDV免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤细胞制备技术获得3株稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞，分别命名13C3A10-2、6G8和12E2H8-2。间接免疫荧光实验结果表明，3株单克隆抗体均能与PEDV疫苗毒CV777及野生毒株产生特异性的荧光信号。Western blot实验表明，3种单克隆抗体均能与病毒N蛋白和重组表达的N蛋白发生反应。
　　应用效价最高的单克隆抗体13C3A10-2作为捕获抗体，PEDV阳性多克隆血清内抗体作为结合抗体，初步建立了双抗体夹心ELISA方法用于检测病料中的PEDV。继而，对于建立的ELISA方法进行了特异性、敏感性、稳定性的检测，应用本方法初步检测了65份病料，并与RT-PCR检测结果进行了符合率的比较。结果表明，符合率为94.7％，可以初步应用于PEDV的检测。

目录

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摘要

第一章 引言

1．1．1 病原学

1．1．2 基因组的结构

1．1．3 结构蛋白基因及其编码蛋白功能

1．1．4 流行病学

1．1．6 防制

1．2 研究的目的和意义

第二章 猪流行性腹泻病毒纯化及重组蛋白表达

2．2．3 TCID50的测定

2．2．7 PEDV核衣壳基因的扩增

2．2．9 重组质粒的构建

2．2．12 重组蛋白的SDS-PAGE分析

2．3．2 病毒纯化

2．3．3 N基因的扩增

2．3．4 质粒重组的鉴定

2．3．5 重组N蛋白纯化

2．3．7 表达产物的Western blot分析

2．4 讨论

第三章 单克隆抗体的制备

3．2．2 饲养层的制备

3．2．6 阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆

3．2．11 Western blot鉴定

3．3．1 小鼠血清效价的监测

3．3．2 间接ELISA检测方法的建立

3．3．4 MAbs抗体效价的测定

3．3．5 Western blot鉴定

3．3．6 IFA鉴定

3．3．7 MAb结合表位分析

3．3．8 MAb相对亲和力测定结果

第四章 双抗体夹心ELISA方法的建立及优化

4．2．3 ELISA基本操作方法

4．2．8 特异性实验

4．2．9 灵敏性实验

4．2．10 重复性实验

4．3．1 抗体纯化

4．3．2 MAb包被浓度与猪阳性多抗稀释度的确定

4．3．3 ELISA判断标准的确定

4．3．4 封闭液浓度和封闭时间的确定

4．3．5 HRP标记山羊抗猪IgG(H+L)抗体浓度及作用时间

4．3．9 重复性实验

4．4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历