代谢型谷氨酸受体2型作为狂犬病病毒入侵宿主细胞受体的研究

摘要

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)引起的一种人兽共患病，以感染中枢神经系统(Central nervous system，CNS)并造成严重神经症状为主要特征，一旦发病致死率高达100％。全世界每年大约60，000人死于该病，其中受影响最为严重的是印度和中国。针对该病通过疫苗接种预防为主，目前尚无有效的治疗药物。 RABV的已知受体包括乙酰胆碱受体、神经细胞粘附分子以及低亲和力的神经营养因子受体等，但是研究表明它们都不能在体内对病毒感染起决定性作用。对于一种多受体病毒，还存在有其他未知的宿主因子在RABV侵染过程中发挥受体功能。 本团队前期研究工作利用人类全基因组RNA干扰文库从HEK-293细胞中筛选出代谢型谷氨酸受体2型(Metabotropic glutamate receptors type2，mGluR2)。mGluR2属于C类G蛋白偶联受体家族(GPCRs)中的Ⅱ型代谢型谷氨酸受体，在中枢神经系统中表达水平相对较高，其表达或功能异常将导致一系列的神经退行性疾病。但是目前尚无研究发现mGluR2在RABV入侵宿主细胞过程中发挥的作用。因此本研究目的首先是证明mGluR2作为RABV入侵宿主细胞的受体，其次研究RABV利用mGluR2内吞的机制。 为了验证mGluR2在病毒入侵过程中发挥的作用，本研究进行了以下实验:通过膜蛋白提取纯化方式证明HEK-293、N2a以及SK-N-SH细胞表面皆存在mGluR2。利用RNA干扰技术，结果表明沉默mGluR2表达明显抑制了RABV对HEK-293、SK-N-SH和N2a三种细胞的感染，而过表达mGluR2后，RABV感染HEK-293的能力有所上升。 接着在证明mGluR2作为RABV入侵宿主细胞受体的过程中，我们首先通过免疫共沉淀(co-IP)和GST-pulldown试验证实mGluR2-GST与RABVG蛋白的胞外区(RABVG-His)具有直接的相互作用，并且这种相互作用在多个狂犬病毒属成员之间具有保守性。mGluR2特异性抗体阻断试验和mGluR2可溶蛋白(mGluR2-GST)中和试验均能够有效抑制RABV感染HEK-293、SK-N-SH、N2a以及小鼠原代神经元细胞(Mouse primary neuron，mPN)。将mGluR2-GST与GX09街毒株混合后通过颅内或肌肉接种后，体内实验数据表明mGluR2胞外区能为小鼠提供保护力，并且这种保护作用具有剂量依赖性。 之后，对于RABV利用mGluR2作为入侵宿主细胞受体的下游机制展开相关研究。首先利用流式细胞术，对病毒粒子感染前后细胞表面mGluR2的表达水平进行检测，结果表明RABV的感染促进了mGluR2的内吞作用。多重免疫荧光染色试验的结果证实RABV和mGluR2一起内吞进入早期和晚期内吞体，而酸性条件下co-IP结果显示RABV G蛋白与mGluR2的互作未受到环境的酸化破坏。沉默β-arrestins2基因的表达促进了RABV感染HEK29细胞，表明病毒与受体的内吞并不需要通过β-arrestins通路。药物激活mGluR2能够对RABV感染HEK-293细胞起到竞争性抑制作用，而病毒感染对于mGluR2下游的cAMP信号通路没有任何影响。 综上，本研究结果表明了mGluR2是RABV感染宿主细胞的受体，并且具有作为狂犬病治疗药物靶点的潜质，为RABV侵染以及致病机制研究提供了理论依据，有利于加快实现消灭人类狂犬病的传播。