镰刀菌致病性及与大豆PI437654抗木贼镰刀菌关联的SNPs和InDels鉴定

摘要

大豆根腐病(Soybean root rot)是大豆[Glycine max(L.)Merr.]生产上严重的土传真菌病害之一，在大豆的整个生长发育周期都有发生。镰刀菌（Fusarium）是世界各地报道和研究较多的一类大豆根腐病致病菌。镰刀菌主要作用于大豆植株维管束，破坏大豆根系的生长，发病时大豆叶片会出现黄化及褐色坏死斑，甚至出现植株萎蔫死亡。抗性品种的筛选和应用是防治大豆根腐病最为高效且可持续的措施之一。鉴定抗性基因是鉴定品种抗性、进行抗性育种及研究抗病机制的前提条件。 本论文主要研究了:(1)从田间大豆病株分离病原物，并通过形态学与分子生物学方法鉴定病原物（镰刀菌），然后通过蘸根法测定分离的病原菌对大豆幼苗的致病性，另外，用活性炭吸附法及有机溶剂萃取法对镰刀菌致病物质进行初步分离;(2)利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变剂处理大豆种子开发大豆中黄13及PI437654突变群体，调查、统计分析大豆突变群体田间形态表型;(3)通过侵染大豆幼苗实验，从开发的突变群体筛选木贼镰刀菌侵染表型显著变化的突变体，并进行全基因组重测序，经基因组数据分析鉴定与木贼镰刀菌抗性关联的SNPs(single nucleotide polymorphisms)和InDels(insertions and deletions)。 在种植2016年开发的大豆PI437654突变体的田间发现了11株根腐病症状的感病植株，从中分离、鉴定到了17个病原镰刀菌(Fusarium spp.)和1个粗毛栓菌(Framete shirsute)。依据形态特征和ITS序列，可将分离得到的17个镰刀菌分为4个种，其中，16个镰刀菌均对中黄13及PI437654表现致病，而18号木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)对大豆PI437654不致病，但对中黄13致病。另外，对木贼镰刀菌的致病物质进行了初步分离，结果表明致病物质为水溶性化合物。 用EMS化学诱变剂处理PI437654和中黄13种子，开发了2个新的大豆突变群体，然后，统计分析M1及M2代突变群体的田间形态表型，其中M2代总形态表型突变率为18.72％。主要的形态表型有黄化，皱缩，矮簇，多叶，种皮颜色变化等。初步筛选出了几株高产、晚熟的性状优良突变体。 用18号木贼镰刀菌侵染PI437654突变群体，筛选感病突变体。从500个PI437654突变体当中筛选到了6个表型显著变化的突变体，这些突变体对18号木贼镰刀菌表现高感，总突变率为1.2％。最后，对其中的2个突变体，L63和L78的9株后代进行了全基因组重测序，经生物信息数据分析鉴定了62个与抗性关联的SNPs和InDels。 采用EMS化学诱变方法开发出理想的大豆遗传种质资源突变群体，不仅可以为大豆抗镰刀菌根腐病基因的鉴定及后续基因功能研究提供良好的遗传材料，同样也可用于其它大豆性状基因的研究以及突变育种。本研究结果为进一步发掘大豆抗病基因及分离、鉴定镰刀菌致病相关毒力因子提供了实验基础，为了解大豆与木贼镰刀菌的分子互作机制、高通量筛选大豆抗性品种及分子标记辅助育种提供了理论依据。