西瓜噬酸菌铁吸收调控因子furA和furB的基因功能分析

摘要

瓜类细菌性果斑病(Bacterial fruit blotch，BFB)是由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli，Ac)引起的、主要侵染西瓜、甜瓜等葫芦科作物的种传细菌性病害，在植物各个生长期均可侵染和为害，具有传播速度快和发病重等特点，极大地限制了瓜类产业的持续健康发展。 在细菌生长、繁殖甚至致病过程中，铁是必需的金属元素，但若细胞内铁离子过量，会参与Fenton和Haber-Weiss反应而产生大量有毒的羟自由基等，损伤细胞甚至导致死亡，因此细菌必须严格调节铁离子水平，该功能主要由铁吸收调控蛋白Fur负责调控。经生物信息学分析，西瓜噬酸菌中存在两个铁吸收调控蛋白FurA和FurB，为探究其在西瓜噬酸菌中的生物学功能，本文以西瓜噬酸菌Aac5为研究对象，构建基因furA和furB单突变菌株△furA、△furB和双突变菌株△furA△furB，以及各自对应的互补菌株，并对以上突变和互补菌株进行了致病性和其他相关表型测定，采用实时荧光定量对致病、铁代谢和应激相关基因进行了表达量分析。结果如下: (1)获取了西瓜噬酸菌FurA、FurB的相关生物学信息 铁吸收调控因子FurA和假定铁吸收调控因子FurB均具有FUR结构域和DNA结合位点，属于Fur家族成员，并FurA中存在两个金属结合位点。FurA与青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的亲缘关系较近，FurB蛋白与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的亲缘关系较近。 (2)构建了试验突变和互补菌株，并测定其致病力和其他相关生物学表型 成功构建突变菌株△furA、△furB和△furA△furB，以及各自对应的互补菌株。表型测定结果显示:与野生菌株相比，△furA和furA△furB均能引起烟草过敏性反应，致病力、运动能力、铁载体产生及生长能力均显著下降，生物膜形成能力显著增强，对过氧化氢和链黑菌素敏感性显著提高，互补菌株能够恢复部分表型;△furB、△furBcomp丧失了致病力和烟草过敏性反应能力，△furB的生物膜形成能力、铁载体产生和生长能力显著下降，运动能力增强，对过氧化氢和链黑菌素敏感性无差异，其互补菌株部分恢复。测定各菌株在不同金属离子(Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Mg2+)浓度的生长能力，发现Fe3+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Mg2+和Ca2+浓度影响△furA的生长能力，△furB在不同Zn2+、Mn2+、Cu2+浓度下生长能力有所变化，△furA△furB在不同Fe3+、Zn2+、Mn2+浓度下生长能力与△furA有差异。以上结果表明FurA和FurB在致病力、生物膜和铁载体形成能力和离子稳态等方面具有重要作用。 (3)验证了furA、furB缺失后，影响Ac的致病、铁代谢和应激相关基因的表达 △furA和△furA△furB中，除了hrpG在△furA中显著提高而在△furA△furB中显著降低外，hrpG、virB、cheA、bamH、tdsR、ftn、sod、σ24和σ54表达量均显著提高，而pilA、bfr和σ28表达量均下降;△furB中，hrpX、cheA、fliC、cat、σ24和σ54表达量均提高，而virB、ftn、tdsR和σ28表达量显著下降，基因furA、furB分别在△furB和△furA中表达量都显著提高。分析表明，△furA和furB都不同程度地调控以上基因表达，且furA在影响virB、pilA、ftn、bfr、tdsR和sod表达中作用更显著，并且两个基因在转录水平上呈负相关关系。