检测拟南芥CDPK基因家族表达的cDNA阵列和RT-PCR方法的建立

摘要

为了较全面地研究拟南芥中存在的42种钙依赖性蛋白激酶(34种CPKs和8种CRKs)所分别具有的可能功能,首先必须建立有效的检测这些蛋白激酶表达及其变化的方法.该论文工作根据拟南芥基因组数据库所给出的34个CPK和8个CRK序列,分别尝试建立了42种钙依赖性蛋白激酶的cDNA阵列和RT-PCR检测方法.对cDNA阵列方法的杂交特异性分析表明,当被检序列与探针序列的同源性达到82％时,其杂交信号强度约是探针与其自身杂交信号强度的30％.在42种被检序列中,仅有两个序列的同源性在80％以上,其余绝大多数序列之间的同源性都在70％以下或更低.结果表明,该工作建立的cDNA阵列方法有较好的特异性,能够满足实验的要求.同时,采用RT-PCR方法对拟南芥CDPK基因家族在正常或渗透胁迫条件下的表达进行了定性分析,初步观测到拟南芥植株中有超过三分之二的CPK基因和CRK基因存在一定程度的表达.这说明RT-PCR方法适用于研究拟南芥CDPK基因家族的低丰度表达.这些方法的摸索和尝试为进一步探讨CDPK在植物细胞信号转导中的作用机制奠定了基础.

目录

ABSTRACT

第一章文献综述

1.1.钙依赖性蛋白激酶(Calcium-Dependent Protein Kinase，CDPK)

1.1.1.CDPK的结构和生化特性

1.1.2.CDPK的生理功能

1.2.植物功能基因组学研究进展

1.2.1.功能基因组学的含义

1.2.2.植物的表达序列标记(Expressed Sequence Tag，EST)与基因组大规模测序

1.2.3.植物基因的功能分析方法

1.3.本研究的背景、目的与意义

1.3.1.拟南芥中的CDPK

1.3.2.本研究的目的与意义

第二章检测拟南芥CDPK基因家族在花粉中表达的cDNA阵列方法的建立

2.1.材料、试剂和仪器

2.1.1.菌株和质粒

2.1.2.工具酶

2.1.3.试剂盒

2.1.4.主要化学试剂和分子量标准

2.1.5.引物和DNA测序

2.1.6.主要仪器设备

2.2.实验方法

2.2.1.从数据库中获取拟南芥全部CPK和CRK序列

2.2.2.设计引物

2.2.3.从拟南芥基因组中PCR扩增拟南芥CPK和CRK基因片段及酶切鉴定

2.2.4.拟南芥CPK片段和CRK片段的构建、转化、筛选和测序

2.2.5.低密度cDNA阵列膜的制作

2.2.6.随机引物法标记探针

2.2.7.cDNA探针的标记

2.2.8.杂交方法

2.3.结果与分析

2.3.1.CPK和CRK基因PCR引物的序列和特性

2.3.2.从拟南芥组DNA中PCR扩增CPK片段和CRK片段

2.3.3.CPK和CRK基因片段所构建的载体、相应的酶切位点及产物大小

2.3.4.测序结果

2.3.5.cDNA阵列杂交特异性分析

2.3.6.试用cDNA阵列方法检测CDPK基因家族在植株和花粉中表达

2.4.讨论

第三章检测渗透胁迫下拟南芥CDPK基因家族表达的RT-PCR方法的建立

3.1.材料与方法

3.1.1.材料、试剂和仪器

3.1.2.重新设计部分引物

3.1.3.从拟南芥组DNA中PCR扩增CPK片段和CRK片段及电泳

3.1.4.材料处理

3.1.5.Tfizol提取拟南芥植株总RNA

3.1.6.反转录

3.1.7.PCR和电泳

3.3.结果与分析

3.3.1.RT-PCR中CPK和CRK基因PCR引物的序列和特征

3.2.2.从拟南芥基因组中PCR扩增CPK片段和CRK片段

3.2.3.试用RT-PCR方法鉴定渗透胁迫下拟南芥CPK基因和CRK基因的表达

3.4.讨论

第四章结论与展望

4.1.结论

4.2.展望

参考文献

致谢