苜蓿中华根瘤菌042BM与耐盐有关基因的克隆和初步分析

摘要

苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)042BM分离自新疆的和田苜蓿,能够在含0.6mol/LNaCl的FY基本培养基中生长.通过Tn5-1063a突变得到042BM的转座子插入突变株,从3000多个突变株中筛选到盐敏感突变株042BM-X1和042BM-X2.耐盐性实验表明,它们都不能在含0.4mol/L NaCl的固体FY培养基和0.5mol/L NaCl的液体FY培养基上生长.Southern杂交结果显示,Tn5在突变株基因组中以单拷贝形式插入,表明突变株的耐盐性下降与Tn5插入突变有关.使用质粒自连法克隆了042BM-X1和042BM-X2中Tn5插入位点的侧翼序列.通过EcoRI酶切突变株基因组,得到完整的Tn5(含有在大肠杆菌中起始复制的oriV)及其侧翼的序列片段,该片段自连后转化大肠杆菌,以Tn5两端已知的序列设计引物进行测序.BLAST的分析测序结果表明,042BM-X1和042BM-X2中Tn5分别定位在苜蓿中华根瘤菌1021染色体上SMc02682和SMc00419基因内部,该实验证明它们和042BM耐盐相关,命名为rst-Ox1和rst-Ox2基因.rst-Ox1基因的功能未知,而rst-Ox2基因和热带根瘤菌谷胱甘肽合成酶基因gshB有很高的同源性.PCR扩增得到包含启动子的042BM rst-Ox1和rst-Ox2基因的全长.序列测定和BLAST分析表明,它们和苜蓿中华根瘤菌1021的相应基因有99﹪同源性,042BM的rst-Ox1基因功能未知,而rst-Ox2基因和热带根瘤菌谷胱甘肽合成酶基因gshB有81﹪同源性.从外源加入谷胱甘肽,能够部分恢复042BM-X2耐盐性,推测谷胱甘肽通过调节细胞内的钾离子浓度,在苜蓿中华根瘤菌042BM渗透胁迫反应中起重要作用.

目录

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缩写

第一章文献综述

1.1细菌渗透调节概述

1.2亲合性溶质

1.3亲合性溶质的生物合成机制

1.4亲合性溶质的运输

1.5亲合性溶质的释放

1.6渗透调节的策略与过程

1.7与亲和性溶质积累无关的渗透胁迫反应

1.8全细胞调节因子σa

1.9转座子和转座子标签法

1.10本论文的研究思路与目标

第二章苜蓿中华根瘤菌042BM盐敏感菌株的获得及其验证

2.1前言

2.2材料和方法

2.3结果

2.3.1 042BM盐敏感突变株的获得及其耐盐性分析

2.3.2盐敏感突变株中Tn5插入的验证

2.4讨论

第三章对042BM盐敏感突变株与耐盐有关基因的定位与分析

3.1前言

3.2材料与方法

3.3结果

3.3.1转座子Tn5插入位点的侧翼序列克隆

3.3.2 042BM-X1中Tn5插入位点的侧翼序列分析

3.3.3 042BM-X2中Tn5插入位点的侧翼序列分析

3.4讨论

第四章PCR扩增042BM与耐盐相关基因及其功能研究

4.1前言

4.2材料与方法

4.3结果

4.3.1 PCR扩增含有042BM rst-Oxl基因及其启动子的DNA片段

4.3.2测序载体pGEM-Oxl的构建及序列测定

4.3.3 PCR扩增含有042BM rst-Ox2基因及其启动子的DNA片段

4.3.4测序载体pGEM-Ox2的构建和序列测定

4.3.5盐敏感突变株042BM-X2的生理功能测定

4.4讨论

结论

参考文献

致谢

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