小麦黄花叶病毒侵染性cDNA克隆及细胞侵染体系的建立

摘要

在中国,由小麦黄花叶病毒(Wheatyellow mosaic virus,WYMV)引起的小麦黄花叶病已严重的危害了小麦的生产.可是,由于寄主植物小麦遗传背景复杂,寄主范围狭窄,机械接种困难,体外病毒粒子不稳定,病毒RNA容易降解等因素,给小麦黄花叶病毒的研究带来了极大的困难.为了对小麦黄色花叶病毒进行深入地分子生物学研究,从细胞及分子水平上认识植物病毒的侵染和复制机制,该研究试图建立一个适于WYMV侵染的室内活体细胞侵染系统,包括病毒侵染性cDNA克隆的构建、烟草原生质体和小麦细胞体系的培养,以及体外转录物的接种和相关的检测技术.该体系的建立为研究其它植物病毒奠定技术基础.该研究首先利用5′RACE方法确认了WYMV-HC基因组的5′端的未知序列,其中RNA1的5′末端多出了15nt(5′-AAAATAAAACCACCA-3′),RNA2的5′末端则多出了12nt(5′-AAAATAAAACCA-3′).利用根据末端序列设计的引物,构建了T7启动子驱动下的病毒基因组的全长cDNA克隆.体外转录结果表明所获得的cDNA克隆可以产生相应的WYMV RNAs.用电击穿孔法将体外转录的WYMV RNAs接种于小麦品种鄂恩1号(Triticum aestivumLEEn.No.1)的愈伤组织和烟草悬浮细胞系BY-2的原生质体内,摸索建立了适用于WYMV病毒颗粒及体外转录RNA侵染植物细胞的侵染体系.对被接种细胞进行的Western blot和Northern blot检测结果表明,体外合成的WYMVRNAs可以在烟草细胞系BY-2和小麦细胞内复制、表达,即该研究所构建的WYMV cDNA克隆具有侵染活性.进一步实验还证明RNA1的5′末端序列(无论是日本分离物5′末端序列还是潢川分离物的末端序列,或者是额外加的一个G对都不影响侵染性)及3′末端poly(A)尾长短(带有26个A和4个A)对WYMV体外转录物的侵染活性也没有明显的影响.在此基础上,进一步完善了该侵染体系.另外,该研究还利用这一侵染体系对WYMV RNA2编码的P1蛋白的功能进行了初步研究.通过构建在pSKCaasSK上的GFP与P1融合基因(包括N端和C端)的瞬时表达载体,用电穿孔法转入细胞(烟草原生质体或小麦细胞),用荧光显微镜观察发现在烟草原生质体内集中在细胞核内发光,而在小麦愈伤细胞内,荧光集中在细胞质内、细胞膜与细胞壁上.分析可能是因为小麦是病毒的天然寄主,所以在小麦细胞内,由于某些因子的存在,P1表现其在天然寄主内的功能,而在非天然寄主烟草细胞内,可能是因为缺乏某些与P1蛋白互作的因子,P1表现异常的定位功能,说明P1的功能与寄主有关,或者说是有寄主专一性的.相对于农杆菌注射法接种单独的GFP于基因烟草16C能引起转录后基因沉默,注射构建在pBIN35S-nos上的GFP与P1融合基因的瞬时表达载体接种转基因烟草16C却能用长波紫外灯观察到更强的荧光表达,初步分析认为,P1蛋白基因可能干扰了转录后基因沉默.

目录

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第一章文献综述

1.1小麦黄花叶病毒的研究进展

1.1.1生物学特性

1.1.2分子生物学特性

1.1.3大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)病毒的特性

1.2植物RNA病毒的侵染性cDNA克隆

1.2.1侵染性cDNA克隆的构建

1.2.2侵染性cDNA克隆的类型

1.2.3影响侵染性cDNA克隆生物活性的因素

1.3植物细胞系在分子植物病毒学研究中的应用

1.3.1植物组织细胞的培养

1.3.2原生质体的分离

1.3.3病毒及病毒RNA对植物细胞和原生质体的侵染

1.4 GFP在植物病毒研究上的应用

1.4.1绿色荧光蛋白

1.4.2应用绿色荧光蛋白研究病毒的运动

1.5研究的目的和意义

第二章小麦黄花叶病毒侵染性cDNA克隆及细胞侵染体系的建立

2.1材料

2.1.1毒源和血清

2.1.2菌株、载体和质粒

2.1.3酶和化学试剂

2.1.4引物

2.1.5细胞

2.1.6培养基和缓冲液的配制

2.1.7仪器设备

2.2方法

2.2.1大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

2.2.2重组质粒的快速鉴定(Cracking)

2.2.3质粒DNA的小量提取

2.2.4质粒DNA的大量提取

2.2.5 DNA片段的回收纯化

2.2.6质粒的酶切和连接方法

2.2.7 PCR反应体系

2.2.8反转录反应体系

2.2.9体外转录反应体系

2.2.10植物总RNA的提取

2.2.11小麦黄花叶病毒提取及纯化

2.2.12病毒RNA提取

2.3侵染性全长cDNA克隆的构建

2.3.1 5′RACE-PCR(Rapid amplification ofcDNA End)

2.3.2 T7启动子控制下的全长克隆的构建

2.4细胞组织培养技术

2.4.1小麦愈伤组织的培养和胚性细胞系的建立

2.4.2烟草细胞的悬浮培养及原生质体的分离

2.5转染

2.5.1小麦细胞的质壁分离转化

2.5.2 BY-2烟草原生质体的电击转化

2.6体外转录物接种后的表达检测

2.6.1 SDS-PAGE和Western Blotting检测

2.6.2 Northern blot检测

2.7结果与分析

2.7.1 5′RACE结果

2.7.2 T7启动子控制下的全长cDNA克隆的构建

2.7.3体外转录物对BY-2烟草原生质体和小麦细胞的侵染

2.8讨论

2.8.1侵染性克隆的构建

2.8.2侵染体系的建立

第三章小麦黄花叶病毒编码的P1蛋白功能的探索性研究

3.1材料

3.1.1引物

3.1.2菌株和植物材料

3.1.3质粒

3.1.4仪器设备

3.2瞬时表达载体的构建

3.2.1 pSK76-GFP及pBIN76-GFP的构建

3.2.2 pSKP1-GFP及pBINP1-GFP的构建

3.2.3 pSKGFP-P1及pBINGFP-P1的构建

3.2.4突变体的构建

3.3 电击转化

3.4农杆菌注射

3.4.1农杆菌感受态细胞的制备

3.4.2植物表达载体向农杆菌感受态细胞的转化

3.4.3 Agro-infiltration方法接种本生烟

3.5 GFP荧光观察

3.6结果与分析

3.6.1瞬时表达载体的构建

3.6.2荧光观察

3.6.3农杆菌注射接种观察结果

3.7讨论

结论与设想

参考文献

致谢

附录Ⅰ GENE PULSER Ⅱ使用方法

附Ⅰ.1 E.coli转化

附Ⅰ.2附件为CAPACITANCE EXTENDER Ⅱ(用来电击细胞)

附Ⅰ.3注意事项

附录Ⅱ Tris-苷氨酸SDS-不连续系统不同浓度凝胶配制用量表

附录Ⅲ实验中部分克隆在M13测序引物间的序列

附录Ⅳ P1WYMV蛋白与马铃薯Y病毒属病毒编码的HC-Pro蛋白氨基酸序列的比较

附录Ⅴ缩略词

作者简历