部分蜘蛛牵丝Ⅰ型蛋白基因合成及其聚合体的表达研究

摘要

蜘蛛牵丝是构成蜘蛛网的框架丝,是目前已知强度最高的天然蛋白质丝,能够与市售制造防弹衣的人工合成纤维相媲美.它由牵丝Ⅰ型和牵丝Ⅱ型蛋白按3:2的比例构成,这两种蛋白质丝在结构上存在许多相似之处,其N端均为串联重复结构,包括由多聚丙氨酸构成的β折叠结构和由其它氨基酸构成的α螺旋与β转角结构,C端含有约100多个氨基酸组成的非重复区.各串联重复区之间以及其与非重复结构区间无其它散在元件.研究表明牵丝的强度主要取决于β折叠结构,而弹性则主要来源于α螺旋和β转角结构.现推测牵丝Ⅰ型蛋白较牵丝Ⅱ型蛋白具有更高强度.该工作以1990年Xu等人报道的金纺者牵丝Ⅰ型蛋白基因序列为基础,通过RNA二级结构分析确立使其结构能级达到较低的密码子,分别合成含有三组多聚丙氨酸的牵丝Ⅰ型蛋白部分重复区序列(单体)及其3'端非重复区多肽基因,并在第三组多聚丙氨酸结构中增加或减少一个丙氨酸,得到三种不同的单体基因.再经过酶切、连接分别获得重复区为2、4、8、16拷贝的聚合体,并将它们与3'端非重复区基因连接获得15种牵丝Ⅰ型蛋白基因类似物.序列比对显示;合成基因八聚体与报道基因所编码氨基酸同源性高达84﹪,二者具有类似mRNA二级结构.另根据重复区基因编码的多肽序列合成含有α螺旋和β-转角结构的半抗原短肽(17AA),通过MBS与抗原KLH连接,连接产物经乳化后免疫成年在雄性新西兰大耳白兔和20g以上雄性Bab/c小鼠,每两周免疫一次,共免疫5次,得到效价为64×10<'4>的兔抗血清及效价为1.0×10<'4>的鼠抗血清,用于检测合成基因的表达.将上述不含非重复区序列的2、4、8聚合体分别克隆大肠杆菌表达载体,经IPTG诱导后,表达菌体总蛋白的SDS-PAGA电泳检测未见明显特异表达带,Western-blot显示无特异带.但采用利福平阻断菌体基因表达,并在培养基中添加<'35>S-Met,通过放射自显影可见由T7启动子起始的特异目的基因表达带.将含有非重复区序列的三种二聚体和三种四聚体克隆真核表达载体,分别转染CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、293T(SV40大T抗原转化的人胚肾细胞)、NBK(新生牛肾细胞)及CV-1(猴肾细胞)系,RT-PCR检测表明具有特异mRNA转录,间接免疫荧光显示目的基因在真核细胞中获得表达,且表达产物趋向于分布在细胞膜上.转染细胞经Zeocine抗性筛选及多次稀释培养,获得稳定表达目的基因的纯系CHO细胞克隆.

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一章文献综述

第一节蜘蛛丝概况和研究进展

1.1蜘蛛丝的组成及大小

1.2蜘蛛丝蛋白基因研究

1.3蜘蛛丝蛋白组成特点

1.4蜘蛛丝蛋白氨基酸组成

1.5蜘蛛纺丝

1.6关于蜘蛛丝产生的进化假设

1.7环境对蜘蛛产生蜘蛛拖丝的影响

1.8蜘蛛丝的机械性能

1.9蜘蛛拖丝

第二节外源基因在大肠杆菌中的表达

2.1前言

2.2影响大肠杆菌中外源重组基因表达的因素

第三节外源基因在哺乳动物细胞的表达

3.1载体类型

3.2.表达载体的结构元件

3.3.宿主细胞

3.4.提高外源蛋白表达的措施

第二章实验材料与方法

1.1菌株、细胞和表达载体

1.2主要仪器设备

1.3分析工具软件

1.4主要试剂

1.5常规溶液及试剂配制

1.6试剂及其它材料

1.7寡聚核苷酸、引物和多肽合成

1.8实验方法

第三章结果

第一节类蜘蛛牵丝Ⅰ型蛋白基因的设计与合成

1.1目的基因的设计

1.2拟合成基因与Ⅰ型牵丝蛋白部分基因的比较

1.3聚合体基因的合成

第二节蜘蛛牵丝Ⅰ型蛋白检测抗体的制备

2.1免疫多肽的合成

2.2抗原制备

2.3免疫结果

第三节类蜘蛛牵丝Ⅰ型蛋白基因在大肠杆菌中的表达

3.1目的基因在原核表达载体中的克隆

3.2大肠杆菌表达载体构建鉴定

3.3合成基因在大肠杆菌中的表达

3.4[3H]释放实验

3.535S标记实验检测目的蛋白的表达

第四节类蜘蛛牵丝Ⅰ型蛋白基因在哺乳动物细胞中的表达

4.1真核细胞表达载体构建

4.2目的基因克隆真核表达载体

4.3目的基因分别在CHO、293T、NBK、CV-1细胞中的瞬时表达

4.4目的基因在CHO细胞中的稳定表达

第五章讨论

第六章结论与展望

参考文献

致谢

附录

个人简历