小麦抗条锈基因Yr-4近等基因系苗期接种后差异表达的cDNA片段的分离

摘要

小麦抗条锈近等基因系Yr4/6*Taichung29经过六代回交选育而成,除去在抗条锈病特性上不同外,在其它遗传特性上与其感病亲本Taichung29极其相似.Yr4/6*Taichung29接种小麦条锈菌CY26小种后呈现非亲和反应;而其感病亲本Taichung29接种小麦条锈菌CY26后呈现亲和反应,表现高度感病.分离抗病近等基因系和其感病亲本之间接种诱导后差异表达的基因有助于我们揭示植物-病原物的互作机理.我们用小麦抗条锈近等基因系Yr4/6*Taichung29和其感病亲本Taichung29为材料,在幼苗一叶期接种小麦条锈菌CY26小种,取接种后24、48、72小时的Yr4/6*Taichung29和Taichung29叶片.然后以Yr4/6*Taichung29叶片作为目标群体,Taichung29叶片对照群体,进行了抑制消减杂交,并且构建了一个包含1300克隆的扣除文库.初步对随机挑选的90个克隆进行反向Northern点杂交分析,以未接种处理Yr4/6*Taichung29、接种处理的Yr4/6*Taichung29和接种处理的Taichung29总RNA分别制备三个探针,与以扣除文库中克隆的PCR产物制备的三张同样的膜杂交,得到在三个探针中杂交信号不同的克隆4个.由于阳性率很低,为了辅助对文库的分析,随机挑选了20个克隆测序,测序结果表明所测片段全部为小麦EST,分析酶切后重构的Rsa 1酶切位点表明SSH过程的连接与杂交过程没有问题.于是对文库中的400克隆用三个探针(分别从未接种处理Yr4/6*Taichung29、接种处理的Yr4/6*Taichung29和接种处理的Taichung29总RNA制备)进行了点杂交筛选,得到在3个探针中杂交信号不同的克隆11个.对点杂交筛选所得到的15个克隆中的4个进行Northern了分析,有两个确证为差异表达的基因,测序结果表明它们分别推测为编码硫氧还蛋白和亮氨酸重复类蛋白的基因.

目录

文摘

英文文摘

独创性声明和关于论文使用授权的说明

第一章前言

1植物对病原物的防卫反应

1.1植物抗病基因

1.2防卫基因

1.3.亲和反应与非亲和反应

2.抑制性扣除杂交技术(SSH)

3.本课题的研究意义

第二章材料与方法

1实验材料

2实验方法

2.1繁殖菌种与接种实验材料

2.2组织总RNA提取

2.3 mRNA提取

2.4.SSH

2.5 PCR产物的克隆

2.6重组质粒的快速提取

2.7重组克隆的分析

2.2.8 Northern分析

2.9Northern分析

2.10阳性克隆的序列测定及生物信息学分析

第三章结果与分析

1.接种后的反应型

2.小麦总RNA的提取

3.3小麦GAPDH基因的350bp扩

4抑制扣除杂交关键步骤的检测结果

5扣除文库的构建与重组克隆的分析

6文库的分析

7点杂交筛选

8 Northern分析

9四个Northern检测克隆的测序，比对分析

第四章讨论

参考文献

附录

致谢