猪干扰素-γ基因在毕赤酵母中的分泌表达及其抗猪瘟病毒活性的研究

摘要

猪干扰素-γ(PoIFN-γ)是由激活的T细胞和NK细胞产生的一类细胞因子，它具有高效抗病毒和免疫调节作用，有广阔的应用前景。为了更好地利用基因工程技术来开发重组猪干扰素-γ制剂，本研究将去除信号肽的猪干扰素-γcDNA基因置于酿酒酵母α因子分泌信号的DNA序列后，构建成能精确分泌表达PoIFN-γ蛋白的重组表达载体pPIC9K-α-PoIFN-γ，通过电转化导入毕赤酵母GS115中，采用G418进行筛选，获得了两株能够高效分泌表达PoIFN-γ的多拷贝插入重组子。提取重组子的基因组DNA，采用PCR方法对重组子进行鉴定，结果表明PoIFN-γ成熟多肽基因成功整合到宿主菌的基因组中。重组子经甲醇诱导表达96h后，离心培养物，取上清用75％硫酸铵4℃沉淀过夜，再用PBS(pH7.4)透析24h，然后进行SDS-PAGE和Westernblot分析，结果表明所获得的两株重组子都能分泌表达出17kD和23kD左右的PoIFN-γ特异蛋白，表达量分别为105mg/L和108mg/L，约占培养液总蛋白的60％。采用PK-15/HCV系统对其中一株重组子的分泌表达产物进行抗病毒活性研究，结果表明所获得的重组PoIFN-γ能够很好地保护猪肾细胞(PK-15株)免受猪瘟病毒HCV(石门系)的感染。　　本研究首次在毕赤酵母表达系统中以分泌形式表达出重组PoIFN-γ，为利用基因工程手段开发重组猪干扰素-γ制剂打下了良好的基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：技术路线、主要缩略词表

独创性声明和关于论文使用授权的说明

第一部分文献综述

综述一毕赤酵母表达系统的研究进展

摘要

前言

1毕赤酵母表达系统的优点

2毕赤酵母的生物学特点

3毕赤酵母表达载体

4毕赤酵母表达宿主菌

5毕赤酵母的转化

6质粒在毕赤酵母中的重组和整合

7外源蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

8 α因子分泌信号的切除

9影响外源蛋白表达水平的因素

综述二猪干扰素-γ的研究进展

1干扰素概况

2猪干扰素-γ的研究进展

第二部分实验部分

实验一毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-α-PoIFN-γ的构建

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

实验二猪干扰素-γ基因在毕赤酵母中的分泌表达

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

实验三重组猪干扰素-γ蛋白抗猪瘟病毒活性的研究

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

结论与展望

REFERENCES

致谢

附录