鲢鱼骨骼肌丝氨酸蛋白酶抑制剂的纯化、性质鉴定及对肿瘤细胞增殖的影响

摘要

本文以内源性的丝氨酸蛋白酶抑制剂作为研究目标；对鲢鱼肌肉中的丝氨酸蛋白酶抑制剂进行了分离纯化，对其进行了基本性质的测定，研究了丝氨酸蛋白酶抑制剂对肌原纤维自溶的影响，并探讨了其对肿瘤细胞生长及细胞周期的影响，为淡水鱼的高效加工利用提供了理论依据。研究显示，鲢鱼肌原纤维蛋白在55℃条件下有着显著的自溶作用。提纯的丝氨酸蛋白酶抑制剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64和金属蛋白酶抑制剂EDTA都能抑制肌球蛋白重链(MHC)的分解；丝氨酸蛋白酶抑制剂对三种肿瘤细胞Sp20、Jarkat、MG63的增殖都有抑制作用。这种抑制作用呈剂量依赖型，其中对Jarkat细胞在0.1g/L的浓度下就可以达到明显的抑制作用。Jarkat细胞在抑制剂处理8h后，细胞周期阻滞在G0/G1期。抑制剂处理Jarkat细胞24h后没有观察到明显的凋亡现象。

目录

文摘

英文文摘

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第一章绪论

1.1蛋白酶抑制剂的研究进展

1.2鱼类的内源性蛋白酶抑制剂研究进展

1.3蛋白酶抑制剂的应用

1.4研究目的、意义与内容

第二章鲢鱼骨骼肌丝氨酸蛋白酶抑制剂的分离纯化

2.1实验材料

2.2实验方法

2.2.1原料鱼的前处理

2.2.2丝氨酸蛋白酶抑制剂的粗分离

2.2.3丝氨酸蛋白酶抑制剂的分离纯化

2.2.4丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的检测

2.2.5纯化过程中蛋白分布的检测

2.2.6蛋白含量的测定

2.3结果与分析

2.3.1最佳粗提溶液的选取

2.3.2丝氨酸蛋白酶抑制剂的分离纯化

2.3.3纯化过程中蛋白分布的检测

2.3.4纯化总结

2.4讨论

2.5小结

第三章鲢鱼骨骼肌丝氨酸蛋白酶抑制剂的性质鉴定

3.1实验材料

3.2实验方法

3.2.1丝氨酸蛋白酶抑制剂的纯度鉴定和分子量测定

3.2.2丝氨酸蛋白酶抑制剂的热稳定性

3.2.3丝氨酸蛋白酶抑制剂的pH稳定性

3.2.4丝氨酸蛋白酶抑制剂对金属离子的稳定性

3.2.5丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制专一性分析

3.2.6丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制活性分析

3.2.7丝氨酸蛋白酶抑制剂的N端氨基酸顺序分析

3.2.8丝氨酸蛋白酶抑制剂的内部氨基酸顺序分析

3.3结果与分析

3.3.1丝氨酸蛋白酶抑制剂的纯度鉴定和分子量测定

3.3.2丝氨酸蛋白酶抑制剂的热稳定性

3.3.3丝氨酸蛋白酶抑制剂的pH稳定性

3.3.4丝氨酸蛋白酶抑制剂对金属离子的稳定性

3.3.5丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制专一性分析

3.3.6丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制活性分析

3.3.7丝氨酸蛋白酶抑制剂的N端氨基酸顺序分析

3.3.8丝氨酸蛋白酶抑制剂的内部氨基酸顺序分析

3.4讨论

3.5小结

第四章丝氨酸蛋白酶抑制剂对鲢鱼骨骼肌肌原纤维蛋白水解的抑制作用

4.1实验材料

4.2实验方法

4.2.1白鲢鱼肌原纤维蛋白的制备

4.2.2蛋白质浓度的测定

4.2.3 SDS-PAGE电泳

4.2.4白鲢鱼肌原纤维蛋白在不同温度下的自溶作用

4.2.5白鲢鱼肌原纤维蛋白在加热条件下不同时间的自溶作用

4.2.6各种蛋白酶抑制剂对白鲢鱼肌原纤维自溶的抑制作用

4.2.7丝氨酸蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶分解白鲢鱼肌原纤维蛋白的抑制作用

4.3结果与分析

4.3.1白鲢鱼肌原纤维蛋白在不同温度下的自溶作用

4.3.2白鲢鱼肌原纤维蛋白在加热条件下不同时间的自溶作用

4.3.3各种蛋白酶抑制剂对白鲢鱼肌原纤维自溶的抑制作用

4.3.4丝氨酸蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶分解白鲢鱼肌原纤维蛋白的抑制作用

4.4讨论

4.5小结

第五章丝氨酸蛋白酶抑制剂对肿瘤细胞体外增殖的影响

5.1实验材料

5.2实验方法

5.2.1细胞培养

5.2.2丝氨酸蛋白酶抑制剂对肿瘤细胞增殖的抑制

5.2.3流式细胞仪PI染色测定细胞周期

5.2.4流式细胞仪PI染色测定细胞凋亡

5.3结果与分析

5.3.1丝氨酸蛋白酶抑制剂对肿瘤细胞增殖的抑制

5.3.2流式细胞仪PI染色测定细胞周期

5.3.3流式细胞仪PI染色测定细胞凋亡

5.4讨论

5.5小结

第六章结论及展望

6.1结论

6.2展望

参考文献

附录

致谢

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