鲫鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂分离纯化、性质鉴定和克隆

摘要

丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serine Protease Inhibitor)作为一类具有抑制蛋白酶活性作用的物质，在动物、植物、微生物中广泛存在，能与体内参与各种调控作用的蛋白酶形成一定的动态平衡，调节生物体内许多重要的生命过程。根据其一级结构、三维模型和作用机制，可将其分为至少18个家族。蛋白酶抑制剂作为调节者，在生物体内一系列的生理作用中起着重要作用。在脊椎动物体内，与血液凝固，纤维蛋白溶解作用，炎症，补体激活有关;在非脊椎动物的免疫中，能调节蛋白酶活性包括血淋巴凝集，酚氧化酶活性以及细胞活素类和抗菌肽合成。由于外源性蛋白酶是重要的病原因子，许多蛋白酶抑制剂能直接抑制病原生物的外源性蛋白酶的水解作用，起到病害防御作用。
　　 研究表明，鱼卵中存在着种类丰富的蛋白酶抑制剂成分，在鱼卵中除执行生理调节功能外，在病原生物防御中也起到了重要作用。然而，截止目前只对少数鱼卵中的蛋白酶抑制剂进行了研究，有关鱼卵自身的防御机制依然存疑。因此，本研究采用鲫鱼卵作为主要研究对象，利用生物化学，分子生物学手段和研究方法，从鲫鱼卵中成功获得了一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，并对其进行进一步性质研究，为进一步探讨其生理、防御功能，及其在食品、医药等领域的利用提供基础数据。本实验主要内容及结果如下:
　　 1、收集四种常见鱼卵（沙塘鳢，鲫鱼，草鱼和乌鳢），以发色底物对其进行丝氨酸蛋白酶抑制活性测定，包括胰蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。结果表明，除胰凝乳蛋白酶外，四种鱼卵提取物对其余3种丝氨酸蛋白酶都具有较强抑制活性。
　　 2、通过ConA Sepharose 4B亲和层析、Sephadex G-75凝胶过滤、反相高压液相等生化技术手段，从鲫鱼卵中获得一个表观分子量约为43kDa的单链蛋白。我们将其命名为CaSPI。CaSPI对胰蛋白酶具有专一性的抑制活性。Edman降解法测序结果显示CaSPI的N-末端氨基酸序列为EAHPSHSGED。糖蛋白检测结果表明CaSPI属于糖蛋白。接合活性测定中，CaSPI在SDS-PAGE电泳时能与胰蛋白酶形成稳定的复合物，该结果提示它可能属于Serpins蛋白超家族中的一员。
　　 3、利用RT-PCR和RACE技术，获得了一条全长为1397bp，其中包括1233bp完整的开放阅读框的核酸序列，编码410个氨基酸。对由核酸序列推测的氨基酸序列分析显示，在52-408处具有SERPIN结构域。经过BLAST比对，该蛋白与来源于鲤鱼围脑膜液的CP9等Serpins超家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂具有高度同源性，并且在P1位置处为精氨酸(Arg)，推测该蛋白属于Sepins超家族一员。
　　 4、对所获得的蛋白酶抑制剂CaSPI进行结合比和及抑制常数Ki测定，结果为CaSPI与胰蛋白酶结合比为1.15:1时能完全抑制蛋白酶水解活性，Ki为0.46μ M，表明CaSPI为竞争性抑制剂。并对其进行稳定性（时间、温度、pH、金属离子及变性剂）检测，表明CaSPI具有相当的稳定性。抑菌活性检测结果显示CaSPI能分别抑制革兰氏阴性菌(Escherichia coli)和革兰氏阳性菌(Bacillus subtilis)的生长，具有一定的抑菌作用。

目录

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前言

第一章 综述

1 蛋白酶抑制剂

1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂分类

1.2 Serpins

2 蛋白酶抑制剂临床应用

2.1 HIV治疗中的应用

2.2 癌症

2.3 糖尿病

2.4 炎症

3 鱼类的病原微生物及防御

4 研究意义与展望

第二章 鲫鱼卵与其它三种常见鱼卵对丝氨酸蛋白酶抑制活性比较

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.2 试剂

1.3 实验仪器

1.4 实验所需试剂的配置

2 方法

2.1 样品制备

2.2 鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂活性检测及抑制程度比较

2.3 鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂的热稳定性及酸碱稳定性检测

3 结果和分析

3.1 鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂活性及抑制程度比较

3.2 鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂的热稳定性及酸碱稳定性

4 讨论

4.1 抑制剂对侵入机制的影响及P1位点作用的探讨

4.2 应用前景展望

第三章 鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂分离纯化、分子量测定及性质鉴定

1 材料和试剂

1.1 试验材料

1.2 试剂

1.3 实验仪器

1.4 实验所需试剂的配置

2 实验方法

2.1 鱼卵匀浆液粗提物制备

2.2 ConA Sepharose 4B亲和层析

2.3 凝胶过滤层析

2.4 反相高压液相层析(RP-HPLC)

2.5 丝氨酸蛋白酶抑制活性检测

2.6 蛋白质浓度测定

2.7 丝氨酸蛋白酶抑制剂分子量的测定

2.8 丝氨酸蛋白酶抑制剂的糖蛋白染色

2.9 丝氨酸蛋白酶抑制剂与trypsin结合

2.10 丝氨酸蛋白酶抑制剂N-端序列测定

3 结果和分析

3.1 鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂分离纯化

3.2 CaSPI分子量的测定

3.3 CaSPI性质鉴定

3.4 N-末端序列分析

4 讨论

第四章 鲫鱼卵Serpin功能基因克隆

1 材料和试剂

1.1 试验材料

1.2 试剂

1.3 实验仪器

1.4 实验所需试剂的配置

2 实验方法

2.1 鲫鱼卵Serpin基因克隆

2.2 生物信息学分析

3 结果和分析

3.1 鲫鱼卵Serpin部分基因克隆

3.2 3’和5'RACE克隆

3.3 鱼卵中Serpin基因生物信息学分析

4 讨论

第五章 CaSPI抑制活性与抑菌作用测定

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.2 试剂

1.3 实验仪器

1.4 实验所需试剂的配置

2 实验方法

2.1 鲫鱼卵中CaSPI抑制活性性质测定

2.2 CaSPI抑制活性的稳定性检测

2.3 CaSPI抗菌活性检测及最小抑菌浓度确定

3 结果和分析

3.1 CaSPI抑制常数(Ki)与结合比测定

3.2 CaSPI稳定性检测

3.3 CaSPI抑菌活性及最小抑菌浓度的测定

4 讨论

全文小结

参考文献

攻读硕士期间发表的论文

致谢