小鼠胚胎OPS管内解冻和直接移植技术及冷冻胚胎MMPs基因表达的研究

摘要

本实验以小鼠为模式动物，研究了不同温度条件下囊胚的冷冻保存，OPS管内解冻和直接移植，体外受精各发育阶段胚胎的玻璃化冷冻以及解冻后胚胎MMP-2和MMP-9基因转录水平的表达情况，为家畜胚胎的玻璃化冷冻和直接移植提供技术参数，并试图从分子水平探讨冷冻胚胎妊娠率低和产仔率低的可能原因。 实验一进行了冷冻液筛选，结果表明，25℃室温和37℃恒温台条件下，选择OPS为胚胎承载物，用EDFS30两步法或者用EFS40一步法均能成功保存小鼠囊胚，25℃室温不使用恒温台条件下，EDFS40一步法或EFS40两步法均能达到理想的冷冻效果；试验二验证了胚胎管内解冻和直接移植方法的可行性，结果显示，OPS细段总长度为2.5cm，EDFS30冷冻液吸入长度小于1cm时，管内解冻与管外解冻后胚胎发育率相比无显著性差异(P＞0.05)，将OPS从装有蔗糖溶液的离心管中移入含有PBS的离心管中浸12min，胚胎的体外发育率不受影响，并且将管内解冻的胚胎用OPS做导管直接移植给假孕受体，胚胎移植受体妊娠率(91.67％)，妊娠产仔率(42.42％)与新鲜胚胎(90.9％和40％)和管外解冻胚胎(84.61％和46.91％)差异不显著(P＞0.05)，该方法应用于小鼠桑椹胚和孵化囊胚后，各自体外发育率与管外解冻组均无显著差异(P＞0.05)；实验三系统研究了体外各发育阶段胚胎的冷冻保存，结果表明，原核胚解冻后囊胚率和孵化囊胚率低于其它各个发育阶段的胚胎，并且与对照组有显著差异(P＜0.05)。2-细胞，4-细胞，8-细胞，桑椹胚冷冻保存后其囊胚率和孵化囊胚率在不同发育阶段无显著差异(P＞0.05)。体内发育实验发现，冷冻2-细胞胚胎妊娠产仔率达57.14％，与新鲜胚胎移植组无显著差异(61.61％，P＞0.05)。冷冻原核胚移植后获得较低的妊娠率和产仔率，与对照差异显著(P＜0.05)。冷冻8-细胞和4-细胞胚胎移植后的妊娠率，产仔率都低于其它发育阶段的胚胎，但与新鲜对照组差异不显著(P＞0.05)。囊胚细胞记数表明，除原核胚外，其余发育阶段胚胎都有很对照相当的囊胚细胞数。试验四使用少量胚胎一步法RT-PCR实验检测小鼠囊胚解冻培养48h后MMP-2和MMP-9基因的表达情况，结果显示，解冻后的体内外孵化囊胚以及新鲜囊胚中未检测到MMP-2mRNA的表达，但MMP-9有明显表达。琼脂糖凝胶电泳灰度值统计结果证实，玻璃化冷冻对MMP-9的表达没有显著影响。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一.章文献综述玻璃化冷冻技术从实验室研究到生产应用的制约因素分析

第二章研究论文

第三章结论和展望

参考文献

致谢

作者简历