GHRH的体外表达和肌肉异位表达对大鼠的促生长分析

摘要

生长激素释放激素(GrowthHormoneReleasingHormone，GHRH)是由下丘脑合成并分泌、存在于人和动物体内的一种生物活性物质，能够促进垂体生长激素(GrowthHormone，GH)的合成与分泌。脑外异位分泌的GHRH蛋白，不论是其成熟形式还是截短的多肽形式，都具有生物活性，并且血清中较低水平的GHRH就能很好的促进GH的分泌。肌肉组织常常作为基因治疗或基因免疫的靶器官，利用肌肉异位表达GHRH，可以提高动物的生长速度和生产效益。 本研究借鉴基因治疗和基因疫苗的原理构建了两种表达猪GHRH的表达质粒——pHC和pCM。表达质粒pHC含有由CMV极早期启动子和猪的骨骼肌alpha-肌动蛋白(α-actm)启动子构成的杂合启动子和杂合内含子(intron)，表达质粒pCM含有CMV启动子用来作为对照。在体外，将6种真核表达质粒pGD、pGC、pGE、pGB、pHC和pCM转染小鼠成肌细胞C2C12进行瞬时表达，另外用不含GHRHcDNA序列的空质粒p5f3f作为阴性对照。转染后C2C12细胞经2％马血清诱导分化为肌管细胞，分别在转染后24h、48h、72h和96h提取细胞总RNA和收集细胞培养上清，采用RT-PCR和Northernblot检测GHRH在mRNA水平上的表达，RIA和Westernblot检测GHRH在蛋白水平上的表达，结果表明GHRH基因得到了成功表达并分泌到细胞外，并且，pCM载体的表达活性高于其他几种载体的表达活性。体内大鼠实验共分为7组(25只/组)，包括6个质粒处理组(0.2mg质粒溶于0.2mlPBS中)和一个对照组(0.2mlPBS)，通过直接肌肉注射异位表达GHRH。结果表明，6种GHRH表达质粒pHC、pGD、pGC、pGE、pCM和pGB对大鼠的生长是有促进作用的，增重提高率分别为6.42％、5.83％、5.32％、2.87％、1.11％和0.35％。从5天的阶段性增重结果来看，在5-10天，pHC质粒处理组大鼠的增重效果显著，为40.73±0.88g而对照组为35.56±1.23g，p＜0.05：在10-15天，pHC质粒处理组增重效果显著，为37.49±2.85g而对照组为33.00±1.56g，p＜0.05；在15-20天，pGC组和pGB组效果显著，分别为28.66±1.39g和26.78±1.40g，而对照组为21.77±1.27g，p＜0.05。同时，质粒处理组大鼠血清IGF-I水平高于对照组。组织切片检查和血清生化指标检测结果表明，通过肌肉注射GHRH表达质粒没有对大鼠造成不良影响。 另外，将肌细胞特异表达基因的几种调控元件序列：肌细胞-特异增强子结合核因子(MEF-1)、MEF-2、转录增强因子-1(TEF-1)和血清反应元件位点(SRE)，经过组合成合成启动子元件，构建成表达载体pSP，以用来作为一种对照。通过在体外转染C2C12细胞，进行了瞬时表达，经Northernblot和RIA检测，结果表明，pSP质粒在C2C12细胞中表达较高水平的GHRH，接近于CMV启动子质粒pCM的表达水平。 通过本研究可以看出，所构建的真核表达载体在体外能够成功表达GHRH，并成功分泌出细胞；体内肌肉异位表达GHRH能够促进大鼠的生长。表明肌肉注射表达质粒的方法是一种安全可靠的促生长手段，为利用基因转染技术提高动物生产性能开辟了一条新途径，有着广阔的应用前景。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一章文献综述

第二章材料与方法

第三章结果与讨论

第四章结论

参考文献

致谢

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