当归多糖对CIK细胞生物学特性、杀伤活性的影响及其相关机制研究

摘要

目的：本实验研究主要探讨当归多糖（Angelica sinensis polysaccharide, ASP）在体外对人外周血来源的细胞因子诱导的杀伤（cytokine induced killer, CIK）细胞在增殖能力、免疫表型、所分泌的细胞因子及其对K562细胞杀伤活性等方面的影响，并初步探讨其可能的机制。
　　方法：采集健康志愿者外周血，用密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，第0 d加入IFN-γ(1000 IU/ml)，24h后再加入IL-2(1000 IU/ml)、抗CD3单抗(50 ng/ml)继续培养，此后每隔3d根据添加不同浓度的ASP分为5组：A组（不加ASP）、B～E组（分别加ASP12.5、25、50、100μg/ml）。各组均置于37℃、5％CO2培养箱中培养，定期观察细胞形态变化，根据细胞生长情况适时进行传代培养。全自动血细胞计数仪计数不同时间各组CIK细胞的绝对数目，计算增殖倍数，并绘制细胞增殖曲线，评估细胞增值情况；流式细胞术检测各组CIK细胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞的百分比；酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组CIK细胞细胞上清液中IL-2、IFN-γ及TNF-α的表达；CCK8法检测各组CIK细胞对K562细胞的杀伤活性；AnnexinV-FITC/PI染色，流式细胞术检测培养第13 d CIK细胞的凋亡率；最后检测CIK细胞在培养至13 d的细胞周期变化。
　　结果：PBMCs体外经多种细胞因子诱导培养后得到大量扩增的CIK细胞。不同检测点各组细胞活率都保持在90%以上；其中培养第16天后E组（100μg ASP组）CIK细胞的增殖倍数为（142.46±9.45）倍，明显高于对照组 CIK细胞（109.53±8.27）倍（P<0.05），差异存在显著统计学意义；各组CIK细胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞亚群的比例在各检测时间点均无明显差异（P>0.05），而D组、E组CIK细胞中CD3+CD56+细胞亚群比例在培养第16 d时分别为（26.65±3.71）%、（28.36±4.28）%与对照组（20.75±3.56）%相比存在差异（P<0.05）；随着培养时间的延长，各组CIK细胞上清液中 TNF-α、IFN-γ的表达呈逐渐上升趋势，在细胞因子 TNF-α的表达方面，培养第16天的CIK细胞中只有高浓度的ASP组（E组）TNF-α的含量较高，与对照组相比（P<0.05），差异有统计学意义，而其余各组表达的TNF-α含量虽较对照组高，但与对照组相比无明显差异。中、高浓度ASP组，即D组、E组CIK细胞所分泌的IFN-γ、IL-2明显较对照组高（P<0.05），差异有显著统计学意义。培养第16d的各组CIK细胞随着效靶比的增高，其杀伤活性依次增强，在效靶比为40:1、20:1、10:1时，E组CIK细胞对K562细胞的杀伤活性分别为（84.19±5.88）%、（76.69±6.54）%、（72.32±9.22）%，而对照组的杀伤活性则分别为（68.05±5.95）%、（64.55±9.44）%、（61.45±8.22）%，相比较高浓度ASP组CIK的杀伤活性更强（P<0.05）；经100μg/ml ASP诱导培养的CIK细胞在不同检测时间点（第7、10、13天） CD25的表达率高，分别为（40.56±4.47）%、（55.34±4.71）%、（20.25±4.79）%，而对照组则为（34.17±3.86）%、（42.24±4.58）%、(14.98±3.67)%，差异有统计学意义（P<0.05），且其下降趋势明显较对照组平缓。用100μg/ml ASP诱导培养的CIK细胞在第13 d的细胞早期凋亡率为（8.38±0.89）%，明显低于对照组（14.31±1.76）%，P<0.05，差异存在显著统计学意义。同为培养第13天的 CIK细胞，用100μg/ml ASP诱导培养的 CIK细胞处于 G1期的细胞百分比为（58.42±3.73）%，低于对照组（70.13±4.56）%，差异明显（P<0.05）；而处于S期的细胞百分比为（29.21±5.64）%，较对照组（16.83±3.63）%明显增高，对比而言差异有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：随着培养时间的延长，中、高浓度的ASP对CIK细胞的增殖有一定的促进作用；中、高浓度的ASP能够促进CIK细胞上清液中TNF-α、IFN-γ、IL-2等细胞因子的表达水平；此外ASP能够增加CIK细胞中的主要效应细胞CD3+CD56+细胞亚群的比例，但对CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞亚群的比例变化影响不大。用ASP诱导培养的CIK细胞对K562细胞有较强的杀伤效应。ASP促进CIK细胞的增殖可能与其促进CIK细胞表面表达IL-2R有关，同时ASP还可通过减少活化CIK细胞的凋亡及促进CIK细胞快速进入S期等方面提高CIK细胞的整体增殖速度。

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前言

立题依据

第一部分 当归多糖对CIK细胞生物学特性及杀伤活性的影响

1 材料与方法

1.1 细胞培养材料及各种试剂、仪器

1.2 相关试剂配置

1.3 实验方法

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 ASP对CIK细胞的增殖作用的影响

2.2 ASP对CIK细胞免疫表型的影响

2.3 各组CIK细胞上清液中细胞因子的表达

2.4 ASP诱导培养的CIK细胞对K562细胞的杀伤能力

3 讨论

4小结

第二部分 当归多糖促进CIK细胞增殖的相关机制研究

1 材料与方法

1.1实验材料

1.2 实验方法

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 ASP对CIK细胞CD25免疫表型的影响

2.2 ASP对CIK细胞凋亡的影响

2.3 ASP对CIK细胞细胞周期的影响

3 讨论

4 小结

结论

参考文献

附：文献综述:CIK细胞的培养及在血液系统恶性肿瘤治疗中的应用进展

致谢

在学期间研究成果