高增殖能力、高细胞毒活性、高存活率的CIK细胞制备方法、相关CIK细胞及应用

摘要

本发明涉及一种高增殖能力、高细胞毒活性、高存活率的CIK细胞制备方法，包括以下步骤：（1）将外周血单个核细胞分选去除CD4+CD25+Treg细胞，得到CIK前期细胞；（2）将CIK前期细胞置于含有100ng/ml PHA、100ng/ml IL-6、10ng/ml PGE2的细胞培养液中培养24小时；（3）转移至经1ug/ml CD3单抗包被的细胞培养瓶中，加入1000U/ml IFN-γ培养48小时；（4）加入1000U/ml IL-2以及100ng/ml IL-1α培养4天；（5）加入1ug/ml胰岛素继续培养7-14天。还提供了相关的CIK细胞及应用、抑制外周血单个核细胞向CD4+CD25+Treg细胞分化的方法及促进CIK细胞增殖的方法。本发明的CIK细胞制备方法设计巧妙，制备得到的肿瘤杀伤细胞-CIK细胞具有较强的增殖能力，较高的毒活性，具有更佳的肿瘤杀伤效率，提高临床疗效，适于大规模推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生命科学与医学的交叉技术领域，特别涉及强化的免疫细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-Induced Killer Cell,CIK）技术领域，具体是指一种高增殖能力、高细胞毒活性、高存活率的CIK细胞制备方法、相关CIK细胞及应用。

背景技术

随着肿瘤对人类生存健康的威胁日益严重，应对肿瘤的治疗模式也发生着日新月异的变化，各种肿瘤治疗的新药物、新技术、新方法层出不穷，其中各种肿瘤的免疫细胞治疗非常活跃，成为肿瘤生物治疗中重要的发展方向。

肿瘤的过继性细胞免疫治疗（Adoptive Cellular Immunotherapy，ACI或AIT）是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞（特异性和非特异性的）直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀肿瘤细胞，可作为手术、放疗、化疗的补充，以提高疗效和改善患者的生存质量。因此，近年来它一直是肿瘤生物治疗中最活跃的领域。

国内外在临床应用的自体免疫细胞治疗肿瘤，主要是细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-Induced Killer Cell,CIK）、树突状细胞（Dendritic Cell,DC）、自然杀伤细胞（NaturalKiller Cell,NK）及γδT细胞，其他T细胞（CTL、CD3AK、DNT）也有临床应用。国内进行自体免疫细胞治疗最早在1996年开始，主要是LAK细胞。近五年主要开展的是CIK、DC细胞治疗。细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)是通过优化培养体系而获得增殖能力更强的异质性细胞群体。

国内外多年的临床研究表明，CIK细胞治疗可以提高患者无病生存期和总生存期，提高机体抗肿瘤免疫功能，改善患者生活质量。目前，在美国国立卫生研究院（National Institutesof Health,NIH）官方临床试验网登记并正在进行的CIK细胞、NK细胞相关临床试验均达数百项之多，其中大约90％的临床试验与肿瘤治疗相关，而各种T细胞的抗肿瘤临床试验更是达到了上千项之多。欧盟与美国还先后分别于2010年和2011年批准了一个通过提高T细胞免疫活性的单克隆抗体易普利姆玛（Ipilimumab/Yervoy）用于晚期黑色素瘤的治疗。

CIK细胞是将人体外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)在体外用多种细胞因子共同培养而获得的一群异质性细胞，其中CD3⁺CD56⁺双阳性细胞为其主要效应细胞，具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、非主要组织相容性复合体（MajorHistocompatibility Complex,MHC）限制性、对正常骨髓造血影响轻微等优点。特别是对于术后清除微小转移灶、防止癌的扩散和复发、提高患者自身抗肿瘤免疫能力有重要作用。对于无法手术或对化疗耐受的中晚期肿瘤患者也可起到改善生活质量、延长生命的积极作用。CD3⁺CD56⁺双阳性细胞在正常人体外周血组分中仅占3%左右，体外在含多种细胞因子的培养基中扩增，可使CD3⁺CD56⁺双阳性细胞数量扩增1000倍以上。

目前CIK细胞的传统制备方法是将分离得到的外周血单个核细胞用干扰素-γ刺激24小时后，再用CD3单抗、IL-1α、IL-2等因子进行刺激。这样得到的CIK细胞中CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺的T细胞含量低、细胞活力和肿瘤杀伤能力低，对肿瘤的治疗效果十分有限。另一方面，对现有CIK细胞制备方法的统计表明，有10%左右的例/次，无法从外周血单个核细胞扩增出CIK细胞，扩增过程中细胞数量没有显著增长。

因此，需要提供一种肿瘤杀伤细胞-CIK细胞的制备方法，其中CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺的T细胞含量高、细胞活力和肿瘤杀伤能力高，对肿瘤的治疗效果好。

发明内容

本发明的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供一种高增殖能力、高细胞毒活性、高存活率的CIK细胞制备方法、相关CIK细胞及应用，该CIK细胞的制备方法设计巧妙，制备得到的肿瘤杀伤细胞-CIK细胞具有较强的增殖能力，较高的毒活性，具有更佳的肿瘤杀伤效率，提高临床疗效，适于大规模推广应用。

为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种高增殖能力、高细胞毒活性、高存活率的CIK细胞制备方法，其特点是，包括以下步骤：

（1）将外周血单个核细胞分选去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞，得到CIK前期细胞；

（2）将CIK前期细胞置于含有100ng/ml PHA、100ng/ml IL-6、10ng/ml PGE2的细胞培养液中培养24小时；

（3）转移至经1ug/ml CD3单抗包被的细胞培养瓶中，加入1000U/ml IFN-γ培养48小时；

（4）加入1000U/ml IL-2以及100ng/ml IL-1α培养4天；

（5）加入1ug/ml胰岛素继续培养7-14天。

较佳地，步骤（2）-（4）中涉及的培养的条件均为37℃、5%CO₂的条件。

较佳地，步骤（1）中的外周血单个核细胞通过采集患者抗凝血并分离得到。

更佳地，所述分离采用的方法为Ficoll密度梯度法。

较佳地，步骤（1）中分选采用的方法是磁珠分选法。

较佳地，步骤（2）中的细胞培养液是AIM-V无血清细胞培养液或X-VIVO无血清细胞培养液（X-VIVO Chemically Defined，Serum-free Hematopoietic Cell Media）。

在本发明的第二方面，提供了一种CIK细胞，其特点是，由上述的高增殖能力、高细胞毒活性、高存活率的CIK细胞制备方法制备而成。

在本发明的第三方面，提供了上述的CIK细胞在制备治疗肿瘤、感染或其它免疫相关疾病的药物中的应用。

在本发明的第四方面，提供了一种抑制外周血单个核细胞向CD4⁺CD25⁺Treg细胞分化的方法，其特点是，在细胞培养液加入100ng/ml IL-6和10ng/ml PGE2培养外周血单个核细胞。

在本发明的第五方面，提供了一种促进CIK细胞增殖的方法，其特点是，在CIK细胞培养4天后加入含胰岛素至终浓度1ug/ml的细胞培养液继续培养。

本发明的有益效果具体在于：本发明的高增殖能力、高细胞毒活性、高存活率的CIK细胞制备方法包括以下步骤：（1）将外周血单个核细胞分选去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞，得到CIK前期细胞；（2）将CIK前期细胞置于含有100ng/ml PHA、100ng/ml IL-6、10ng/ml PGE2的细胞培养液中培养24小时；（3）转移至经1ug/ml CD3单抗包被的细胞培养瓶中，加入1000U/ml IFN-γ培养48小时；（4）加入1000U/ml IL-2以及100ng/ml IL-1α培养4天；（5）加入1ug/ml胰岛素继续培养7-14天，通过该方法诱导得到纯度较高的CIK细胞，培养中加入1000U/ml IFN-γ，并用1ug/ml CD3单抗包被提高CIK细胞毒活性，同时加入100ng/ml IL-6、10ng/ml PGE2抑制单核细胞向CD4⁺CD25⁺Treg细胞分化，加入胰岛素至终浓度1ug/ml以及1000U/ml IL-2促进细胞增殖，设计巧妙，制备得到的肿瘤杀伤细胞-CIK细胞具有较强的增殖能力，较高的毒活性，具有更佳的肿瘤杀伤效率，提高临床疗效，适于大规模推广应用。

附图说明

图1是本发明制备的CIK细胞和常规方法制备的CIK细胞培养不同时间活细胞率比较图。

图2是在细胞培养过程中加入和不加入100ng/ml IL-6及10ng/ml PGE2培养外周血单个核细胞的CD4⁺CD25⁺Treg细胞分化率比较图。

图3是细胞培养过程中加入和不加入胰岛素至终浓度1ug/ml培养CIK细胞的扩增倍数比较图。

图4是细胞培养培养过程中加入和不加入100ng/ml IL-6及10ng/ml PGE2以及胰岛素至终浓度1ug/ml培养的CIK细胞对K562的杀伤率检测。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究和反复试验发现：采集并分离单核外周血单个核细胞，分选去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞，得到CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺的T细胞。将得到的细胞置于含有PHA（100ng/ml）、IL-6（100ng/ml）、PGE2（10ng/ml）的培养液中，培养24小时后，移至经CD3单抗（1ug/ml）包被的细胞培养瓶中，加入IFN-γ（1000U/ml），48小时后加入IL-2(1000U/ml)、IL-1α（100ng/ml），4天后补充含有胰岛素1ug/ml的培养基继续培养7-14天，即可得到高增殖力，高细胞毒活性的CIK细胞。具体是：

1、分离患者抗凝血得到单个核细胞；

2、分选去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞，获得CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺的T细胞；

3、含采用含PHA（100ng/ml）、IL-6（100ng/ml）、PGE2（10ng/ml）的无血清培养基重悬所获细胞，孵育24小时后，移至经CD3单抗（1ug/ml）包被的细胞培养瓶中，（将抗CD3单抗包被在培养瓶壁上，比游离状态的效果更好，所需的单抗总量降低，而又增加了CIK细胞的增殖力），加入IFN-γ（1000U/ml）；

4、48小时后加入IL-2(1000U/ml)、IL-1α（100ng/ml）；

5、4天后补充含胰岛素1ug/ml,的培养基，继续培养7-14天，其中每隔1-2天分瓶培养一次，即可得到高增殖力，高细胞毒活性的CIK细胞。

本发明的制备方法为培养前使用分选法去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞，培养中加入IFN-γ（1000U/ml），并用抗CD3单抗（1ug/ml）包被提高细胞毒活性，同时加入IL-6（100ng/ml）、PGE2（10ng/ml）抑制单核细胞向CD4⁺CD25⁺Treg细胞分化，加入胰岛素至终浓度1ug/ml，IL-2(1000U/ml)促进细胞增殖。

因此，本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种抑制单核细胞向CD4⁺CD25⁺Treg细胞分化的方法，即在培养液中加入IL-6（100ng/ml）、PGE2（10ng/ml）。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：一种促进CIK细胞增殖的方法，即在细胞培养4天后加入含胰岛素至终浓度1ug/ml的细胞培养液继续培养。

上述方法制备的CIK细胞，其能用于制备治疗各种肿瘤、治疗感染及其他免疫相关疾病的药物中。

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。但本发明并不受实施例的限制。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。

实施例1CIK细胞的制备

1、外周血单个核细胞（PBMC）的制备（Ficoll密度梯度法）

用无菌注射器无菌条件下采集患者抗凝血30-50ml，1500rpm/min离心15分钟后，吸取上层血浆，56℃灭活30分钟，放4℃，30分钟后离心3000rpm/8min，去沉淀，放4℃冰箱待用。用生理盐水对倍稀释血细胞沉淀，比重为1.077的人淋巴细胞分离液与稀释血按1:2的比例加入离心管中，2000rpm/min离心20分钟，小心抽取白细胞层，用生理盐水清洗两次，低速离心后得到PBMC。

2、Mini MACS去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞（Mini MACS高度磁珠分离柱（德国MACS公司））

取PBMC细胞悬液调整到适宜的细胞浓度，加入PE-labeled AntiHuman CD25，4℃孵育30min后取出，以MACS专用PBS离心洗涤3次，再加入Anti-PE磁珠，同样置4℃孵育30min，过MACS柱，MACS柱内为阳性分选所得到的CD4⁺CD25⁺Treg细胞，洗脱下来的为去除Treg细胞所得到的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺的CIK前期细胞。

3、将得到的CIK前期细胞，置于含有PHA（100ng/ml）、IL-6（100ng/ml）、PGE2（10ng/ml）的培养液中，37℃，5%CO₂的培养箱中孵育24小时后，移至经CD3单抗（1ug/ml）包被的细胞培养瓶中，加入IFN-γ（1000U/ml），48小时后加入IL-2(1000U/ml)、IL-1α（100ng/ml），4天后补充含有胰岛素终浓度1ug/ml的培养基继续培养7-14天，即可得到高增殖力，高细胞毒活性的CIK细胞。

实施例2：CIK细胞的检测

1、CIK细胞活细胞检测

加入PHA、INF-γ后，大部分细胞仍呈悬浮状态；3天后细胞体积增大，细胞逐渐聚集成团，细胞透亮，胞质丰富；第5天开始，细胞开始大量增殖，细胞形态多样，细胞集落增多；取培养第1、5、7、9、11、13、15、17、19天的CIK细胞100ul，加入100ul 0.4%胎盘蓝染色液，活细胞不被染色，死细胞都被染成蓝色。请参见图1所示（其中实验组为本发明制备的CIK细胞即实施例1制备的CIK细胞，对照组为常规CIK培养（按照发明名称为“淋巴细胞培养液及培养淋巴细胞的方法和应用”的中国发明专利ZL200710079562.X披露的方法）的CIK细胞，本发明制备的细胞活细胞率检测均在90%以上，且在第15、17天活细胞率显著高于对照组即常规方法制备组。

2、CIK细胞增殖力及免疫表型检测

分别取培养1、5、7、9、11、13、15天100ul浓度约10⁶/ml的细胞，分别加入检测用鼠抗人CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC抗体10ul，室温避光孵育30分钟，用生理盐水洗涤两次，流式细胞仪检测发现，本发明制备的细胞中CIK细胞扩增倍数平均在1025，CD3⁺CD56⁺Treg细胞从(2.2±0.3)%急速扩增，在培养第15天用流式细胞仪检测达到峰值(63.4±0.6)%。而采用相同的方法进行检测，采用常规CIK培养（按照发明名称为“淋巴细胞培养液及培养淋巴细胞的方法和应用”的中国发明专利ZL200710079562.X披露的方法）的CIK细胞的扩增倍数为698±43倍，因此本发明制备的CIK细胞扩增倍数显著增加。

3、CIK细胞对K562的杀伤作用检测

CIK细胞按效靶比例2.5:1、5:1、10:1、20:1、40:1加入K562接种24小时的96孔板内，共同培养24小时后加入新鲜配制的5mg/ml的MTT 10ul，共同培养4小时，离心吸弃上清液，每孔加DMSO 100ul振荡溶解10分钟，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔数值减去空白对照孔，求出3个复孔的平均A值。以杀伤率计算效应细胞的细胞毒活性，杀伤率（%）=[靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)]/靶细胞对照A值x100%。结果显示本发明制备的CIK细胞效靶比为10:1时对K562细胞的杀伤活性即达到90%，而常规方法（按照发明名称为“淋巴细胞培养液及培养淋巴细胞的方法和应用”的中国发明专利ZL200710079562.X披露的方法）制备的细胞效靶比为40:1时的杀伤率才达到80%。

实施例3：100ng/ml IL-6及10ng/ml PGE2抑制外周血单个核细胞向Treg细胞分化

取培养第15天CIK细胞，调整浓度约为106/ml的细胞至100μl，分别加入检测用鼠抗人CD3-PerCP、CD4-FITC、CD25-FITC抗体10ul，室温避光孵育30分钟，用生理盐水洗涤两次，流式细胞仪检测发现，请参见图2所示，实验组（按照实施例1的相关步骤，将CIK前期细胞置于含有PHA（100ng/ml）、IL-6（100ng/ml）、PGE2（10ng/ml）的培养液中，37℃，5%CO₂的培养箱中孵育24小时得到的CIK细胞，其CD4⁺CD25⁺细胞的分化率为0.0074%±0.0002%）与对照组（将CIK前期细胞置于仅含有PHA（100ng/ml）未含IL-6（100ng/ml）、PGE2（10ng/ml）的培养液中，37℃，5%CO₂的培养箱中孵育24小时得到的CIK细胞，其CD4⁺CD25⁺细胞的分化率为0.068%±0.0083%）相比，差异显著，（*：p<0.05），说明100ng/mlIL-6及10ng/ml PGE2能够抑制外周血单个核细胞向CD3⁺CD25⁺Treg细胞分化。

实施例4：胰岛素至终浓度1ug/ml促进CIK细胞增殖

取培养第15天CIK细胞计数，请参见图3所示，实验组（即本发明的实施例1制备的细胞，其4天后补充含有胰岛素终浓度1ug/ml的培养基培养的CIK细胞，其扩增倍数为1025±36倍）与对照组（其它步骤相同而4天后未补充含有胰岛素终浓度1ug/ml的培养基培养的CIK细胞，其扩增倍数为698±43倍）相比，差异显著，（*：p<0.05），说明胰岛素至终浓度1ug/ml能够显著促进CIK细胞增殖。

实施例5：100ng/ml IL-6及10ng/ml PGE2以及胰岛素至终浓度1ug/ml的协同作用

将培养第15天的CIK细胞按效靶比例2.5:1、5:1、10:1、20:1、40:1加入K562接种于96孔板内，共同培养6小时后加入新鲜配制的5mg/ml的MTT 10ul，共同培养4小时，离心吸弃上清液，每孔加DMSO 100ul振荡溶解10分钟，用酶标检测仪在570nm处测定吸光度A值。同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照。每孔数值减去空白对照孔，求出3个复孔的平均A值。以杀伤率计算效应细胞的细胞毒活性，杀伤率（%）=[靶细胞对照A值-(实验孔A值-效应细胞对照A值)]/靶细胞对照A值x100%。请参见图4所示，结果显示：实验组（本发明制备的CIK细胞，即实施例1制备的CIK细胞，也就是加入100ng/ml IL-6及10ng/mlPGE2以及胰岛素至终浓度1ug/ml）与对照组（细胞培养培养过程中不加入100ng/ml IL-6及10ng/ml PGE2以及胰岛素至终浓度1ug/ml，其它条件相同）制备的CIK细胞）相比，对K562细胞的杀伤活性显著增加，其中实验组效靶比10:1、20:1、40:1时的杀伤率分别为87.7%±0.7%、91.6%±1.4%、95.3%±0.0002%，证实胰岛素联用IL-2、PEG2对增强CIK细胞的杀瘤能力有协同作用。

本发明制备出的CIK细胞的生物学特性如下：

（1）细胞组成：T淋巴细胞（CD3⁺）大于90%。T淋巴细胞中各亚群的比例因个体差异有一定变化范围，一般为CD3⁺CD56⁺细胞为40-70%，CD4⁺CD8⁺细胞为65-85%。

（2）增殖数量高：本发明的人体CIK细胞培养方法扩增的数量比传统CIK细胞显著增加，体外培养15天后前者细胞的扩增倍数比后者多300多倍。

（3）杀瘤活性高：用MTT法检测二者的杀伤活性，结果：本发明的人体CIK细胞杀伤活性明显提高，CD8⁺细胞比例显著增加，抗瘤谱广，细胞毒活性显著增强等特点。对术后的肿瘤患者可有效预防转移复发；与放化疗联合应用可降低前者的毒副作用，增强患者耐受力，提高疗效；对晚期患者可明显延长生命周期，提高生活质量。

本发明为解决现有方法制备的CIK细胞增殖力不高、细胞毒活性较低的缺点，在普通免疫细胞培养基础上，通过优化培养体系而获得细胞增殖能力更强、杀伤活力更大的肿瘤杀伤细胞群体。该培养体系制备所得的CIK细胞具有较强的增殖能力，较高的毒活性，具有更佳的肿瘤杀伤效率，提高临床疗效。

综上，本发明的高增殖能力、高细胞毒活性、高存活率的CIK细胞制备方法设计巧妙，制备得到的肿瘤杀伤细胞-CIK细胞具有较强的增殖能力，较高的毒活性，具有更佳的肿瘤杀伤效率，提高临床疗效，适于大规模推广应用。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。