鸡精液稀释液设计与筛选方法学研究

摘要

迄今为止，国内外虽有不少有关鸡精液稀释液研究的相关报道，但关于精液稀释液设计与筛选方法学的研究尚属缺乏。在这一领域没有一套完整而实用的理论体系，对诸如精液稀释液pH、渗透压、缓冲能力和配方物质组成进行调控、筛选和评价，如缓冲能力就没有具体参数可供借鉴，也缺乏测定方法等。有鉴于此，本论文拟从方法学的角度，探索鸡精液稀释液设计与筛选方面的指标体系和测定方法，用以指导制备高受精率的鸡精液稀释液，以适应现代养鸡生产的需要。 本论文包括三个部分，第一部分是鸡精液稀释液设计与主要液体质量指标的确定、控制与测定研究。对精液稀释液pH、渗透压和缓冲能力梯度进行理论控制，然后以实际测定结果检验控制的准确性。第二部分是鸡精液稀释液实验室筛选研究——稀释精液体外精子生存质量与形态学观察研究。通过研究不同pH、渗透压、缓冲能力和溶质种类的稀释液以及保存时间和温度对保存于其中的精子形态和机能的影响，确定最佳稀释液的合理参数。第三部分是鸡稀释精液人工授精应用研究，以稀释精液进行人工授精，以受精率对稀释液及其设计和筛选方法的优劣做出客观的评价。 实验结果表明：①pH的理论控制准确率在98.69﹪，渗透压准确率在95.9﹪-99.1﹪，缓冲指数准确率在97.6﹪以上。 ②在2℃-5℃低温条件下，稀释液缓冲指数不影响精子活率，但影响精子畸形率。缓冲指数348时，精子畸形率极显著地低于缓冲指数119.6～228.8和461.6～1147.6范围的畸形率。为了保持精子正常的形态，不但要求要有合适的pH和渗透压，同时还要求有适中的缓冲指数。稀释液缓冲指数对精子畸形率的影响较精子活率的影响大。 ③柠檬酸钠、葡萄糖对鸡精液的保存，具有重要作用，而氯化钾在鸡精液稀释液中并不是必需的；复方稀释液保存效果普遍优于单方稀释液；低温下鸡精液稀释液渗透压应为等渗或接近等渗，且最适渗透压还与构成稀释液的物质种类和相互配比有关系；稀释液PH应接近中性，最好与精液pH保持一致；在缓冲指数为3.894-7.257的范围内，缓冲指数与精子保存效果的两个指标均呈现显著的负相关关系。 ④精子最高生存指数出现在三种有机盐的稀释液中；两种无机盐液中精子存活时间最长，但精子畸形率很高；渗透压值与精子头部畸形类型高度相关(p＜0.01)，与精子头部弯曲且膨胀百分数的相关系数为-0.93，与精子头部单纯弯曲百分数的相关系数为0.94。在300mmol/L时，精子生存指数、存活时间均较好；500mmol/L时精子畸形率最低；渗透压对保存效果有极显著的影响，物质种类对保存48h精子形态有显著地影响，且渗透压与精子畸形类型有一定关系。 ⑤无机盐氯化钠、氯化钾在350mmol/L渗透压浓度单独使用时可以获得较高的精子存活时间和精子生存指数，但不利于维持鸡精子细胞膜的完整性。有机盐柠檬酸钠、柠檬酸钾在350mmol/L渗透压浓度时精子存活时间和生存指数比400mmol/L渗透压浓度时要低，可知最佳的渗透压浓度在350mmol/L-400mmol/L之间。谷氨酸钠在250mmol/L渗透压浓度时，精子存活时间、精子生存指数和精子形态完整率均较好，其最佳渗透压不是等渗，而是偏低渗。在本实验条件下这三中有机盐液对鸡精子形态有稳定和保护作用。葡萄糖、蔗糖、果糖单成分液均有稳定或保护鸡精子形态完整的良好作用；葡萄糖的最适渗透压浓度接近250mmol/L，蔗糖的在200mmol/L-250mmol/L之间。氯化钠和氯化钾以5∶1比例制成350mmol/L渗透压浓度时可以获得比单独使用时更高的精子存活时间和生存指数，但不能改变无机盐对鸡精子细胞膜的破坏作用。250mmol/L谷氨酸钠和450mmol/L的果糖以1∶2组合后可以获得较为理想的鸡精子机能和形态保存效果。 ⑥由果糖、谷氨酸钠、柠檬酸钾和硫酸镁四种物质组成的7液最好，其pH为6.7，渗透压为360mmol/L，缓冲指数为382，精子存活时间264h，活率大于0.6的存活时间148h，生存指数133。另外3液、4液、8液和9液保存效果亦较好，表明在pH6.7-7.2，渗透压278mmol/L-434mol/L，缓冲指数280-582的范围内，对精子的生存较为适宜。这一结果与在37℃下保存试验的结果基本一致。 ⑦通过37℃下对鸡精液进行稀释保存效果的观察，发现保存效果最好的是6-3和6-4液，其精子存活时间分别为9.9±1.55h，9.4±1.56h，生存指数分别为3.76±1.22，3.50±1.31，与其它几个稀释相比，差异极显著(p＜0.01)。从而证明：适宜精子37℃下存活的pH范围是6.7～7.75，渗透压为335mmol/L-395mmol/L，缓冲指数为350。同时，结果表明，只有稀释液的pH，渗透压和缓冲指数均合适时，保存效果才会好。 ⑧鸡精子在渗透压为738、703mmol/L的1＃、2＃液中不能生存；在390、290和145mmol/L的6＃、7＃、8＃液中，存活时间依次为9.8±1.66h、9.1±1.43h、8.9±1.45h，生存指数依次为3.7±1.14、3.3±1.28、3.2±1.32极显著地长或高于3＃、4＃液的2.4±0.78h、3.2±0.81h和0.12±0.07、0.58±0.11(P＜0.01)，显著地长或高于5＃液的6.5±1.21h和1.3±0.42(P＜0.05)。表明适于精子生存的渗透压以等渗为宜，但同时受配方物质成分的影响。 ⑨稀释液溶剂是影响稀释保存效果的重要因素，以注射用水制备的3液精子存活时间和生存指数分别为134.5h、48.58，显著地优于以蒸馏水制备的稀释液。在葡萄糖-磷酸盐稀释液中，添加谷氨酸钠比添加柠檬酸钠保存效果好，精子存活时间和生存指数分别提高22﹪、33.5﹪。另外，在3℃保存鸡精液时，稀释液等渗条件比添加能源物质如葡萄糖更重要。 ⑩通过对4个精液稀释液的pH、渗透压、缓冲指数、3℃-5℃下精子存活时间与生存指数的测定，并在生产条件下用这4个稀释液进行人工授精试验表明：鸡精液稀释液pH、渗透压、缓冲指数是影响精子存活时间、生存指数和受精率的重要因子。pH为7.0，渗透压为330mmol/L，缓冲指数为461的1号液，精子存活时间为254±33h，生存指数为95±22，受精率为96.4﹪，极显著地高于原精对照组和另外3个稀释液。 通过以上实验结果可以得出以下结论：通过本文建立的计算和实测方法预先对精液稀释液的pH、渗透压和缓冲能力三项液体指标进行控制，能够准确地设定待配精液稀释液的物理指标，为精液稀释液的实验室筛选奠定良好基础；采用精子机能指标(精子总存活时间、精子生存指数)和精子形态学指标(精子形态完整率或精子畸形率)相结合的评价指标体系，在实验室低温(1℃-5℃)和高温(37℃)下进行稀释精液保存实验，对稀释液的pH、渗透压和缓冲能力以及配方物质进行效果筛选，能够获得近似实用的稀释液配方；在生产条件下对通过实验室选出的稀释液进行人工授精实验，以种蛋受精率的高低来衡量和筛选精液稀释液的优劣，能够最终得到供实际应用的稀释液配方。从而证明本论文建立的鸡精液稀释液设计与筛选方法学的正确性和可行性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

第一部分文献综述

第二部分实验研究

第一章 鸡精液稀释液设计与主要液体质量指标的确定、控制与测定研究

第二章：鸡精液稀释液实验室筛选研究——稀释精液体外精子生存质量与形态学观察测定

实验一稀释液pH、渗透压和缓冲能力与1℃～4℃下鸡精液保存效果

实验二精液稀释液缓冲能力与2℃-5℃保存鸡精子活力和畸形率关系的研究

实验三精液稀释液溶质种类和渗透压对鸡精子体外保存时间和形态的影响(Ⅰ)

实验四精液稀释液溶质种类和渗透压对鸡精子体外保存时间和形态的影响(Ⅱ)

实验五精液稀释液pH、渗透压和缓冲能力对3℃～5℃鸡精液保存效果的影响

实验六37℃下稀释液pH、渗透压和缓冲能力对鸡精子存活的影响

实验七37℃下稀释液渗透压对鸡精子存活的影响

实验八影响鸡精液3℃保存效果几个因素的分析

第三章鸡稀释精液人工授精应用研究

致谢

参考文献

附录

版图页：

作者简介及在读博士期间的工作成绩

导师简介

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