Axin1在运动调节骨骼肌糖代谢和肌发育再生中的作用研究

摘要

目的:骨骼肌约占人体体重40%-60%,在物质代谢和机体运动方面发挥重要作用。骨骼肌不仅是人体最大的能量代谢器官,还是内分泌器官(分泌肌肉素、肌肉抑制素、胰岛素样生长因子等生长因子)。骨骼肌疾病常见于代谢性疾病(肥胖和糖尿病),遗传性疾病(进行性骨骼肌营养不良,如DMD)和衰老相关疾病(少肌症)等。体轴发育抑制蛋白Axin1是一种多功能结构支架蛋白,参与多种信号通路。文献报道Axin1在脂肪组织中参与胰岛素促进葡萄糖的摄取。胰岛素和运动/肌肉收缩是促进骨骼肌摄取葡萄糖的生理性作用,运动/肌肉收缩的作用机制不同于胰岛素,尚不明确,阐明其调节骨骼肌糖代谢的机制有助于预防和治疗糖尿病。此外,骨骼肌发育过程涉及到细胞增殖和分化,骨骼肌损伤后激活肌卫星细胞开始增殖、分化,进而再生为成熟骨骼肌,完成修复过程。肥胖和糖尿病个体骨骼肌质量下降,运动和代谢功能障碍,并且骨骼肌损伤后肌再生能力下降,但肥胖和糖尿病对骨骼肌发育和损伤后再生的影响机制尚不清楚,有待明确。方法:本课题主要分为两部分第一部分:本部分借助C2C12小鼠骨骼肌细胞株和多种小鼠模型,探讨Axin1在运动/肌肉收缩促进骨骼肌葡萄糖摄取机制中的作用。体内C57BL/6小鼠跑台运动、体外用电脉冲刺激(EPS)C2C12骨骼肌肌管收缩,借助激活剂、抑制剂、siRNA和腺病毒,上调或者下调AMPK活性或Axin1、Tiam1蛋白水平,pull down实验检测Rac1活性,ELISA检测骨骼肌细胞GLUT4转位,2-NBDG检测骨骼肌细胞葡萄糖摄取,Western blot检测相关的蛋白及其磷酸化水平。第二部分:本部分主要探讨Axin1在肥胖和糖尿病小鼠骨骼肌发育和再生中的作用。体外实验,运用过表达质粒和siRNA调节C2C12骨骼肌细胞Axin1蛋白水平,利用qRT-PCR、Western blot、免疫荧光和流式细胞术等方法检测Axin1对骨骼肌细胞增殖和分化的影响。用高胰岛素造成骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型,检测Axin1对细胞增殖和分化的影响。体内实验,运用心肌毒素(CTX)建立小鼠骨骼肌损伤模型,利用qRT-PCR和Western blot检测Axin1及骨骼肌再生相关基因和蛋白表达,HE和免疫荧光染色观察骨骼肌再生情况。用高脂饮食造成小鼠胰岛素抵抗模型,用CTX诱发胰岛素抵抗小鼠肌损伤,用腺相关病毒敲降Axin1,检测Axin1对胰岛素抵抗小鼠骨骼肌再生的影响。结果:第一部分结果显示:1.肌肉收缩时消耗能量,AMP/ATP比值、糖原利用和乳酸产生升高。2.运动/肌肉收缩通过上调Axin1增强其与AMPK结合,激活AMPK,促进骨骼肌摄取葡萄糖。3.AMPK通过Tiam1激活Rac1,参与收缩促进骨骼肌摄取葡萄糖的作用。第二部分结果显示:1.敲降Axin1抑制骨骼肌细胞增殖并促进其分化,反之,过表达Axin1促进细胞增殖并抑制其分化。骨骼肌细胞胰岛素抵抗时,Axin1表达升高,细胞增殖升高,分化降低,而敲降Axin1增加骨骼肌细胞分化。2.CTX造成骨骼肌损伤,骨骼肌再生过程中Axin1表达下降、β-catenin表达升高、Wnt信号通路激活。3.肥胖和糖尿病小鼠骨骼肌中Axin1表达升高、骨骼肌分化受损、骨骼肌再生障碍,敲降Axin1改善肥胖小鼠骨骼肌再生障碍。结论:Axin1参与多种信号通路,在骨骼肌中发挥重要作用。运动/肌肉收缩通过AMPK/Axin1-Tiam1-Rac1信号通路促进骨骼肌摄取葡萄糖;Axin1参与骨骼肌的发育和再生,下调Axin1抑制骨骼肌细胞增殖并促进分化,下调Axin1表达改善肥胖小鼠的骨骼肌发育和再生。

目录

Abstract

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、Axin1 在运动/收缩促进骨骼肌摄取葡萄糖机制中的作用研究

1.1 对象和方法

1.1.1 细胞

1.1.2 主要试剂

1.1.3 主要溶液配制

1.1.4 仪器设备

1.1.5 实验方法及流程

1.1.6 数据处理

1.2 结果

1.2.1 EPS 升高骨骼肌细胞 AMP/ATP 比值、糖原利用和乳酸产生

1.2.2 敲降 Axin1 抑制 EPS 促进 C2C12 肌管细胞 GLUT4 转位和 葡萄糖摄取的作用

1.2.3 运动/收缩上调骨骼肌Axin1 表达

1.2.4 AMPK 上调 Axin1 蛋白水平

1.2.5 EPS 以 AMPK 依赖的方式上调 Axin1 表达

1.2.6 运动/收缩上调骨骼肌Tiam1 表达

1.2.7 EPS 以 AMPK 依赖的方式上调 Tiam1 表达

1.2.8.Tiam1 的表达依赖 AMPK 和 Axin1,但三者并不形成复合物

1.2.9.敲降 Tiam1 不影响 EPS 促进 AMPK 磷酸化的作用

1.2.10.抑制 Rac1 不影响 EPS 上调 Axin1 和 Tiam1 表达

1.2.11. EPS 以 AMPK 依赖的方式上调 Tiam1 丝氨酸磷酸化

1.2.12. Tiam1 介导运动/收缩促进骨骼肌 GLUT4 转运和葡萄糖摄取的作用

1.3 讨论

1.4 小结

二、Axin1 在肥胖和糖尿病小鼠骨骼肌发育和再生过程中的作用

2.1 对象和方法

2.1.1 细胞

2.1.2 试剂

2.1.3 溶液配制

2.1.4 主要仪器和设备

2.1.5 方法

2.1.6 数据处理

2.2 结果

2.2.1 Axin1 参与细胞周期与分化过程

2.2.2 敲降Axin1 抑制骨骼肌细胞增殖并促进其凋亡

2.2.3 过表达Axin1 促进骨骼肌细胞增殖并抑制其凋亡

2.2.4 敲降Axin1 抑制高胰岛素造成的骨骼肌细胞增殖

2.2.5 Axin1 通过 Cyclin D1 促进骨骼肌细胞增殖

2.2.6 Axin1 通过 Cyclin D1 抑制高胰岛素造成的骨骼肌细胞增殖

2.2.7 敲降Axin1 促进骨骼肌细胞分化

2.2.8 过表达Axin1 抑制骨骼肌细胞分化

2.2.9 肌管细胞胰岛素抵抗时骨骼肌分化受损

2.2.10 敲降Axin1 缓解胰岛素抵抗的骨骼肌细胞分化受损

2.2.11 β-catenin、MyoD 和 MyoG 蛋白存在互作关系

2.2.12 敲降 Axin1 上调胞核 β-catenin 水平

2.2.13 Axin1 不影响 MyoD 表达水平

2.2.14 小鼠不同骨骼肌中Axin1 均有表达

2.2.15 肥胖和糖尿病小鼠的骨骼肌分化受损

2.2.16 敲降小鼠骨骼肌Axin1 促进骨骼肌分化

2.2.17 小鼠骨骼肌发育过程中Axin1 表达升高

2.2.18 肌再生中Axin1 表达降低

2.2.19 敲降Axin1 增强骨骼肌再生

2.2.20 肥胖小鼠肌损伤再生修复能力降低

2.2.21 敲降Axin1 改善肥胖小鼠肌再生障碍

2.3 讨论

2.4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

综述 2型糖尿病:调节骨骼肌葡萄糖摄取的分子机制

综述参考文献