表达AMV，WCMV外壳蛋白基因的红三叶T1，T2代分子生物学检测及抗病性分析

摘要

红三叶病毒病是除根节线虫之外的一大病害，其中尤以苜蓿花叶病毒（Alfalfa Mosaic Virus，AMV）和白三叶花叶病毒（White Clover Mosaic Virus，WCMV）最为猖獗。大面积草地喷施农药不仅成本高，而且会造成环境污染，对畜产品的安全性也有影响。培育抗AMV和WCMV的转基因红三叶新品种是解决问题的根本途径。要实现转基因植物的多抗效果，目前常用的方法有：构建双元、多元载体，然后进行遗传转化；给已经转入一个抗性基因的植株用转基因手段再转入另外一个抗性基因；在不同的抗病转基因植株之间进行人工杂交。 本研究以抗苜蓿花叶病毒（AMV）转基因红三叶和抗白三叶花叶病毒（WCMV）的转基因红三叶人工杂交后代T1，T2代植株为研究对象，探讨目的基因在人工杂交后代中的表达情况及其抗病性强弱。研究结果如下； 1）分别用改进的CTAB法和植物基因组试剂盒提取34个T1代植株DNA样品和30个T2代植株DNA样品及1个非转基因对照DNA样品，经琼脂糖凝胶电泳检测，所有条带均清晰无污染，利用试剂盒提取DNA较手提法时间短、质量好。对提取的30个T2代植株的RNA进行琼脂糖凝胶电泳分析，条带完整、清晰。 2）34株T1代植株PCR检测结果显示，5株AMV、WCMV阳性，6株WCMV阳性，1株AMV阳性，3株仅nptⅡ阳性。 3）30株T2代PCR检测结果显示所有T2代植株nptⅡ均呈阳性，其中10株AMV、WCMV均阳性，13株WCMV阳性、3株AMV阳性。 4）对T2代转基因红三叶进行RT-PCR检测，分别得到预期大小的条带。其中，9个正常转录并表达AMV和WCMV外壳蛋白基因，3个表达AMV外壳蛋白基因，6个表达WCMV外壳蛋白基因，3个表达nptⅡ基因。 5）30株T2代植株有21株能够表达外壳蛋白基因，表明外源基因可以通过人工杂交遗传至后代，并在大部分植株中能够正常转录，并且，通过人工杂交能够实现两种外源基因在同一植株中的累集。 6）对T2代阳性植株进行苜蓿花叶病毒和白三叶花叶病毒的抗病性检测。与对照相比，转基因红三叶T2代整体抗性水平明显高于对照，回接转基因植株与对照的汁液至寄主豇豆，转化植株产生的枯斑数也明显小于对照。表明通过人工杂交获得的T2代转基因植株具有较强的抗病性。

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论文说明:缩略词

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1文献综述

1.1 引言

1.2文献综述

1.2.1植物抗病毒基因工程的研究进展

1.2.2转基因植物检测与鉴定研究现状

1.2.3植物病毒检测方法概述

1.2.4红三叶基因工程及抗病分子育种研究现状

2材料与方法

2.1实验使用的主要试剂和仪器

2.1.1主要试剂

2.1.2常用溶液及缓冲液

2.1.3仪器设备

2.2转基因红三叶T1代植株外源基因整合检测

2.2.1试验材料

2.2.2实验方法

2.3转基因红三叶T1代植株的人工杂交及穴盘育苗

2.3.1人工杂交

2.3.2穴盘育苗

2.4转基因红三叶T2代植株外源基因整合检测

2.4.1材料

2.4.2方法

2.5转基因红三叶T2代植株外源基因转录水平检测

2.5.1试验材料

2.5.2 RNA实验器皿的预处理

2.5.3方法

2.6转基因红三叶T2代植株对AMV、WCMV的抗性检测

2.6.1材料

2.6.2试验方法

3结果与分析

3.1转基因红三叶T1代植株外源基因整合检测

3.1.1 T1代植株及对照DNA琼脂糖凝胶电泳结果

3.1.2转基因红三叶T1代植株外源基因整合PCR检测

3.2转基因红三叶T1代植株人工杂交

3.3转基因红三叶T2代植株外源基因整合检测

3.3.1转基因红三叶T2代植株及对照DNA提取

3.3.2转基因红三叶T2代植株外源基因整合PCR检测

3.4转基因红三叶T2代植株外源基因转录水平检测

3.4.1转基因红三叶T2代植株及对照RNA提取

3.4.2转基因红三叶T2代植株外源基因整合RT-PCR检测

3.5转基因红三叶T2代植株对AMV、WCMV的抗性检测

3.5.1 T2代接种AMV、WCMV病毒结果

3.5.2接种后AMV、WCMV在转基因与对照植株体内积累的差异

4讨论

4.1 DNA、RNA提取及RT-PCR技术要点

4.2目的基因在转基因红三叶后代中的累集

4.3外源基因在转基因植株后代中的遗传

4.4转基因植株的抗病性检测

5结论

参考文献

致 谢

附录

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