马铃薯遗传转化体系的优化及无机焦磷酸酶基因导入的研究

摘要

本研究的主要目的是构建马铃薯无机焦磷酸酶(PPase)基因的植物表达载体，并对农杆菌介导的马铃薯试管薯遗传转化体系进行优化，然后将PPase基因导入马铃薯栽培品种中，以期对马铃薯块茎的休眠和发芽特性进行调控。取得的主要研究结果如下： 1.将马铃薯PPase基因与原核表达载体pET-28a融合，构建了原核表达载体pET-PPA，然后导入大肠杆菌BL21(DE3)中，经SDS-PAGE分析表明PPase基因在大肠杆菌中能够表达。 2.将PPase基因分别与组成型启动子CaMV 35S、块茎特异表达启动子CIPP和低温诱导表达型启动子rd29A融合，构建了植物表达载体pBI-SP、pBIC-SP和pBIr-SP，通过冻融法导入根癌农杆菌LBA4404中，经酶切鉴定和PCR检测证明表达载体己导入农杆菌中。 3.以马铃薯栽培品种甘农薯2号和Favorita为试验材料，利用固体培养、固液培养和液体培养法进行了试管薯的诱导，并对其农杆菌介导的遗传转化体系进行了优化研究。结果表明，固体培养、固液培养和液体培养法诱导的甘农薯2号试管薯单瓶平均结薯数分别为4.6、4.4和6.5个，块茎平均直径分别为6.2、5.8和7.7 mm；Favorita单瓶平均结薯数为5.4、5.8和7.4个，平均直径分别达6.2、5.9和7.3 mm。用浓度为OD600=0.5的菌液，侵染8min，共培养2d能够获得较高的转化频率，其转化频率甘农薯2号和Favorita分别可达42.6％和36.8％。 4.以两个马铃薯栽培品种甘农薯2号和Favorita的试管薯为供体材料，分别用组成型启动子CaMV35S、块茎特异表达启动子CIPP和低温诱导表达型启动子rd29A驱动的PPase基因表达载体pBI-SP、pBIC-SP和pBIr-SP进行遗传转化，获得了部分转基因马铃薯。通过PCR扩增初步表明PPase基因已整合到马铃薯的基因组中。

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论文说明：缩略语表

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第一章引言与文献综述

1.1马铃薯块茎休眠和发芽现象

1.2影响马铃薯块茎休眠和发芽的生理因素

1.3马铃薯块茎休眠和调控

1.3.1块茎体眠机理

1.3.2块茎休眠过程中的生理代谢

1.4焦磷酸酶(Pyrophosphatase，PPase)基因

1.4.1植物焦磷酸酶(PPase)的研究进展

1.4.2马铃薯PPase的研究进展

1.5马铃薯块茎休眠和发芽的分子生物学研究进展

1.6本研究的目的和意义

第二章马铃薯PPase基因在大肠杆菌中的表达

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1菌种和载体

2.2.2酶和试剂

2.2.3 PPase基因在大肠杆菌中的表达

2.3结果与分析

2.3.1 PPase基因原核表达载体的构建

2.3.2 PPase基因在大肠杆菌中的诱导表达

2.4讨论

第三章PPase基因植物表达载体的构建

3.1前言

3.2材料和方法

3.2.1菌种和载体

3.2.2酶和试剂

3.2.3质粒DNA制备

3.2.4大肠杆菌感受态细胞制备及转化

3.2.5农杆菌感受态细胞的制备及冻融法转化

3.2.6 CaMV35S启动子驱动的PPase基因表达载体构建

3.2.7 CIPP启动子驱动的PPase基因表达载体构建

3.2.8 rd29A启动子驱动的PPase基因表达载体构建

3.3结果与分析

3.3.1 CaMV 35S启动子驱动的PPase基因表达载体的构建

3.3.2表达载体pBI-SP酶切鉴定

3.3.3质粒pBI-SP导入农杆菌PCR扩增鉴定

3.3.4 CIPP启动子驱动的PPase基因表达载体pBIC-SP构建

3.3.5表达载体pBIC-SP酶切鉴定

3.3.6质粒pBIC-SP导入农杆菌PCR扩增鉴定

3.3.7 rd29A启动子驱动的PPase基因表达载体pBIr-SP构建

3.3.8表达载体pBIr-SP酶切鉴定

3.3.9质粒pBIr-SP导入农杆菌PCR扩增鉴定

3.4讨论

第四章马铃薯遗传转化体系的优化

4.1前言

4.2材料和方法

4.2.1实验材料

4.2.2试剂

4.2.3试验材料的繁殖与壮苗

4.2.4试管薯诱导的培养方法

4.2.5试管薯的遗传转化与植株再生

4.3结果与分析

4.3.1培养方法对马铃薯试管薯诱导的影响

4.3.2试管薯遗传转化条件的优化

4.4讨论

4.4.1试管薯的诱导方法

4.4.2农杆菌介导的遗传转化体系的优化

第五章PPase基因转化马铃薯的研究

5.1前言

5.2材料与方法

5.2.1植物材料与繁殖

5.2.2菌株和质粒

5.2.3酶和试剂

5.2.4马铃薯的遗传转化

5.2.5转基因马铃薯检菌测验

5.2.6转基因马铃薯PCR检测

5.3结果与分析

5.3.1转基因马铃薯植株再生

5.3.2转基因植株PCR鉴定

5.4讨论

致谢

参考文献

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