具有潜在免疫调节功能Lactobacillus菌株的体外筛选及作用机理研究

摘要

微生物对人类免疫系统发挥着重要的影响，具有免疫调节功能的益生菌株的研究和筛选是目前功能食品研究的一个热点。Lactobacillus属的一些菌株可以增强机体特异性和非特异性免疫功能，有助于维护机体健康。
　　 本研究采集甘肃、青海、新疆、西藏传统发酵食品及健康婴儿粪便，分离其中的乳酸菌，并采用体外研究方法从分离获得的菌株中筛选具有潜在免疫调节功能的Lactobacillus益生菌株。
　　 采用半选择性培养基，从传统发酵食品和婴儿粪便中分离得到具有产酸能力的168株革兰氏阳性杆菌、39株革兰氏阳性球菌，过氧化氢酶试验为阴性，杆菌经果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶试验均为阴性，初步鉴定为乳酸杆菌，在传统发酵发酵食品分离过程中也发现有酵母存在。
　　 以分离得到的168株杆菌为筛选具有潜在免疫调节功能的目标菌株，与人外周血单核细胞（PBMCs）共同培养，采用酶联免疫法（ELISA）测定培养上清液中白细胞介素-12（IL-12，p70）的浓度。从168株杆菌中筛选出刺激PBMCs产生IL-12（p70）浓度较高的菌株34株。并采用ELISA方法测定初筛获得的34株杆菌刺激PBMCs产生肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、γ-干扰素（IFN-γ）的浓度，筛选出8株刺激PBMCs产生IL-12（p70）、IFN-γ和TNF-a3种细胞因子浓度较高的菌株，作为具有潜在免疫调节功能的菌株，分别编号为J23ANL、J5ANL、IN1ANL、SB5AL、SB31AL、M5AL、G15AL、T3AL。采用Biolog微生物鉴定系统将菌株J23ANL、M5AL和G15AL鉴定为Lactobacillus paracasei supsp.paracasei；菌株J5ANL、IN1ANL、SB5AL、SB31AL鉴定为Lactobacillusrhamnosus；T3AL鉴定为Lactobacillus coryniformis supsp.torquens。
　　 采用模拟胃、肠液研究获得的8株Lactobacillus菌株在人体胃肠道环境中的耐受性，在人结肠癌腺细胞系HT-29上的粘附能力以及对致病菌增殖的抑制能力。8株Lactobacillus菌株在模拟胃液中暴露1 h，仍能保持一定的活菌数，在模拟胃液中暴露3 h，活菌数进一步下降，只有菌株J23ANL、J5ANL、IN1ANL、SB5AL，和M5AL仍可检出活菌，而G15AL、T3AL、SB31AL不能检出活菌。8株菌在模拟肠液中的耐受性较好，在模拟肠液中暴露4 h，仍能保持较高的活菌数。不同菌株在HT-29细胞上的粘附能力不同，其中菌株IN1ANL、M5AL和G15AL有较强的粘附性，其余菌株粘附性较差。8株Lactobacillus菌株对致病菌E.coli、S.typhimurium和S.sonnei繁殖有抑制作用。
　　 进一步研究筛选获得的8株Lactobacillus菌株活菌体、热灭活菌体、细胞壁及DNA对人PBMCs增殖、细胞因子（IL-12（p70）、IFN-γ和TNF-a）的产生及NK细胞杀伤活性的影响，说明不同菌体成分的免疫调节功能。结果表明菌株J23ANL、J5ANL、IN1ANL、SB5AL、SB31AL、M5AL、G15AL、T3AL活菌体细胞、热灭活菌体细胞及细胞壁均使人PBMCs增殖，且当完整菌体与细胞壁作用浓度增大时，对PBMCs增殖系数减小，而菌体DNA对PBMCs增殖的影响均小于完整菌体和细胞壁对PBMCs增殖的影响。菌株J23ANL、J5ANL、IN1ANL、SB5AL、SB31AL、M5AL、G15AL、T3AL活菌体细胞、菌体细胞壁均能显著增强NK细胞杀伤活性。除菌株SB31AL，其它菌株DNA均显著增强NK细胞杀伤活性。菌株增强NK细胞杀伤活性与菌株刺激免疫细胞产生细胞因子有关。菌株J23ANL、J5ANL、IN1ANL、SB5AL、SB31AL、M5AL、G15AL、T3AL活菌体细胞、热灭活菌体、细胞壁和DNA均能刺激人PBMCs产生细胞因子IL-12（p70）、TNF-a和IFN-γ，但各菌株细胞壁、DNA刺激PBMCs产生IL-12和TNF-α的水平均低于活菌体刺激产生细胞因子的水平。
　　 采用3-（4，5-dimethylthiazol-2-y1）-2，5-diphenyltetrazolium bromide（MTT）法研究8株Lactobacillus菌株菌体成分（包括热灭活完整菌体细胞、菌体细胞壁和菌体DNA）对人结肠癌细胞系HT-29及人慢性髓原白血病细胞K562增生的抑制作用，并采用单细胞凝胶电泳（Single cell gel electropherosis，SCGE）研究菌体成分是否诱导肿瘤细胞凋亡。结果表明，筛选得到的8株Lactobacillus菌株热灭活菌体细胞、菌体细胞壁和菌体DNA均对HT-29细胞的增生产生显著抑制。其中，菌株Lactobacillus coryniformis ss torquens T3AL对HT-29细胞的抑制率显著高于其它菌株的抑制率。单细胞凝胶电泳结果表明菌株T3AL菌体各成分诱导HT-29细胞凋亡，从而抑制HT-29细胞的增生。各菌株热灭活菌体均抑制K562细胞增生；IN1ANL、SB5AL、SB31AL、M5AL、G15AL、T3AL菌株细胞壁对K562细胞的增生具有不同程度的抑制作用，而菌株J23ANL、J5ANL细胞壁对K562细胞增生无抑制作用；菌株G15AL、M5AL、SB31AL的菌体DNA抑制K562细胞增生，其它菌株DNA均对K562细胞的增生无抑制作用。
　　 体外试验结果表明，从传统发酵食品和健康婴儿粪便中筛选获得的8株Lactobacillus菌株具有潜在的免疫调节功能，在胃、肠道环境有一定耐受性，能够抑制病原菌生长以及抑制肿瘤细胞的增生。但它们在益生功能方面表现出不同差别，需要针对这些特点进一步深入研究其免疫调节等益生功能。