重组毕赤酵母产S-腺苷蛋氨酸的发酵条件优化及其分离提取

摘要

S-腺苷蛋氨酸(SAM)是L-蛋氨酸的活性形式，具有转甲基、转氨丙基、转硫基的作用，它对治疗肝病、抑郁症、关节炎等疾病具有较好的疗效，且副作用小。国内对SAM的研究起步较晚，因发酵水平限制、分离纯化成本高及其不稳定性，到目前为止国内仍未能工业化生产SAM，市场上用于治疗的SAM产品全部依赖于进口。
　　 针对SAM的低产现状，本论文首先建立了利用HPLC-UV测定发酵过程SAM浓度的方法，对HPLC-LN法检测SAM含量的色谱条件进行优化，最佳色谱条件：流动相为0.01mol/L甲酸铵(甲酸调pH3.5，0.22μm水膜过滤)：甲醇=97:3，流速：0.6 mL/min，柱温30℃，检测波长：260 nm。同时还建立了利用自制甲醇传感器检测发酵液中甲醇浓度的两种方法：尾气测量法及硅胶管测量法。尾气测量法响应时间短、检测方便；硅胶管测量法以0.1mL/min氮气为载气，稳定性良好。
　　 其次，在摇瓶发酵的基础上考察了L-蛋氨酸及甲醇浓度对重组毕赤酵母发酵生产SAM的影响。实验结果表明，L-蛋氨酸浓度及甲醇浓度对重组毕赤酵母发酵生产SAM有显著的影响。在发酵培养基中添加7.5 g/L L-蛋氨酸，SAM产量最高，达到0.81 g/L。利用甲醇传感器监测发酵过程甲醇浓度，甲醇浓度在10-30 g/L之间，最有利于SAM的生产，其中在15 g/L甲醇浓度下获得的SAM产量最高，达到1.41 g/L，相比每隔24 h补加1%甲醇的对照组，SAM产量提高了21%。
　　 进一步在7L发酵罐上对甘油-甲醇混合流加培养基的流加方式进行了优化。7L发酵罐对甲醇诱导阶段补加不同甘油含量的甘油-甲醇混合流加培养基的研究结果表明，流加不同甘油含量的甘油-甲醇混合流加培养基对SAM的产量有影响，在发酵过程流加10%(w/v)甘油-甲醇混合流加培养基，SAM产量最高，达到6.09 g/L。在甲醇诱导的不同时间段，分别流加不同甘油含量的甘油-甲醇混合流加培养基，SAM产量得到进一步提高，达到9.79g/L。
　　 最后，对所收获的毕赤酵母菌体破壁，提取胞内SAM并进行了初步的分离提取。以pH反复冻融法取代高氯酸抽提法对SAM进行抽提，提取率达93.78%。对得到的SAM粗提液进行初步的分离纯化，以pH3.0磷酸氢二钠-柠檬酸作为吸附过程缓冲液效果较佳，SAM吸附率达99.3%，以1 mL/min，0.05 mol/L的硫酸溶液进行洗脱，流洗2倍柱体积的硫酸溶液即能将样品洗脱完全。整个分离提取过程SAM的回收率达74.7%。

目录

文摘

英文文摘

第1章 引言

1.1 SAM概述

1.1.1 SAM简介

1.1.2 SAM的生物学功能

1.1.3 SAM的临床应用

1.1.4 SAM的制备

1.2 毕赤酵母表达系统简介

1.2.1 外源蛋白表达系统

1.2.2 毕赤酵母表达系统分类

1.3 利用毕赤酵母表达外源蛋白过程中甲醇浓度的控制

1.4 甲醇及SAM在毕赤酵母中的代谢

1.5 本论文的研究目的和意义

1.6 本论文主要的研究内容

1.6.1 SAM测定方法的建立及甲醇传感器测定甲醇浓度的研究

1.6.2 甲醇及L-蛋氨酸对摇瓶发酵生产SAM的影响

1.6.3 毕赤酵母发酵生产SAM诱导过程碳源优化

1.6.4 SAM的初步分离

第2章 SAM测定方法的建立及利用甲醇传感器测定甲醇浓度的研究

2.1 前言

2.1.1 SAM测定方法

2.1.2 利用甲醇传感器测定甲醇浓度

2.2 实验材料

2.2.1 主要实验试剂

2.2.2 主要实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 HPLC测定SAM方法的建立

2.3.2 利用甲醇传感器测定发酵液中甲醇浓度的研究

2.4 实验结果及讨论

2.4.1 SAM测定方法的建立

2.4.2 利用甲醇传感器测定发酵液中甲醇浓度的研究

2.5 小结

第3章 甲醇及L-蛋氨酸对摇瓶发酵生产SAM的影响

3.1 前言

3.2 实验材料与方法

3.2.1 菌种

3.2.2 培养基

3.2.3 主要实验仪器

3.2.4 培养方法

3.2.5 分析方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 初始培养条件下摇瓶试验结果

3.3.2 L-蛋氨酸添加量对毕赤酵母摇瓶发酵生产SAM的影响

3.3.3 甲醇浓度对SAM摇瓶发酵的影响

3.4 小结

第4章 毕赤酵母发酵生产SAM诱导过程碳源优化

4.1 前言

4.2 主要实验试剂及菌种

4.2.1 菌种

4.2.2 主要实验试剂

4.2.3 主要实验仪器

4.3 实验方法

4.3.1 平板菌种活化：

4.3.27L罐发酵试验：

4.3.3 分析方法

4.4 结果与讨论

4.4.1 不同甘油添加量对7 L罐发酵生产SAM的影响

4.4.2 不同补料方式对7 L罐发酵生产SAM的影响

4.5 小结

第5章 SAM的分离提取

5.1 前言

5.2 主要实验试剂与实验仪器

5.2.1 主要实验试剂

5.2.2 主要实验仪器

5.3 实验方法

5.3.1 细胞破壁方法的选择

5.3.2 SAM的初步分离纯化

5.4 结果与讨论

5.4.1 细胞破壁方法的选择

5.4.2 静态吸附条件的优化

5.4.3 毕赤酵母发酵液中SAM的初步分离纯化

5.5 小结

第6章 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

致谢

参考文献

在学期间发表的学术论文