枯草芽孢杆菌EL32分泌的弹性蛋白酶的纯化及性质研究

摘要

弹性蛋白是一种由Ala、Leu、Ile等非极性氨基酸残基交联而成的抗酸碱及抗一般蛋白酶消化的硬蛋白。弹性蛋白酶是一种以特异性水解不溶性弹性硬蛋白为特征的广谱蛋白水解酶，在食品、医疗、化妆品工业中有着广阔的应用前景。利用微生物发酵生产弹性蛋白酶具有高产量、较低的生产成本等优点。国内外有关微生物法发酵生产弹性蛋白酶的研究较多，主要集中在产酶菌株筛选、发酵工艺优化等方面，而对弹性蛋白酶的性质研究相对较少。本文对前期分离的弹性蛋白酶产生菌株EL32进行鉴定，并对其弹性蛋白酶进行了纯化及性质研究，主要结果如下：
　　 菌株EL32的16S rDNA与枯草芽孢杆菌的16S rDNA的同源性达到99%，其菌落呈乳白色，其细胞革兰氏染色阳性，具有芽孢；发酵葡萄糖试验产酸不产气，明胶水解试验呈阳性，能够水解淀粉，V-P反应呈阳性，鉴定为枯草芽孢杆菌。
　　 采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Sephacryl-S HR100凝胶层析从枯草芽孢杆菌发酵液中纯化得到了电泳纯的弹性蛋白酶，SDS-PAGE分析显示其分子量为31kDa。用LTQ-MS测定肽指纹图谱表明该弹性蛋白酶是枯草芽孢杆菌蛋白酶(substilisin)，其基因克隆表明该蛋白酶与枯草芽孢杆菌蛋白酶(substilisin)的序列同源性高达99%。对菌株EL32弹性蛋白酶的三维结构模拟发现His、Asp和Ser是其活性中心的关键基团。
　　 枯草芽孢杆菌EL32弹性蛋白酶的最适pH值为7.4，pH稳定范围6.0-8.5，最适温度为50℃。该弹性蛋白酶活力受到Fe2+、Zn2+、Al3+、Mn2+、Cu2+、Ca2+、Co2+、Ba2+和EDTA的抑制，但在25%的甲醇、乙醇、二甲亚砜、异丙醇中较稳定。以刚果红弹性蛋白为底物，测定该酶的米氏常数Km和Vmax分别为14.3 mg/mL和35.7 U/mg；以酪蛋白为底物，该酶的米氏常数Km和Vmax分别为1.7 mg/mL和1428.6 U/mg。该弹性蛋白酶能够有效地水解牛肉，牛筋和牛蛙皮。
　　 本文鉴定了一株产弹性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株，确定了其弹性蛋白酶是枯草芽孢杆菌蛋白酶，证实了该弹性蛋白酶能高效水解多种食品原料中的蛋白质，为该酶在食品工业的应用提供了理论基础。

目录

文摘

英文文摘

第1章 引言

1.1 弹性蛋白酶简介

1.2 弹性蛋白酶降解弹性蛋白的机理

1.2.1 弹性蛋白的性质

1.2.2 弹性蛋白酶降解弹性蛋白的机制

1.3 弹性蛋白酶的来源

1.4 弹性蛋白酶的分离纯化

1.5 弹性蛋白酶的酶学性质

1.6 弹性蛋白酶的基因及酶蛋白质结构

1.7 弹性蛋白酶的应用

1.7.1 在医药方面的应用

1.7.2 在食品工业方面的应用

1.7.3 在日用化工方面的应用

1.8 本论文的研究背景及内容

第2章 弹性蛋白酶产生菌株EL32的鉴定

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.2.1 菌株EL3216S rDNA序列的同源性分析

2.2.2 菌株EL32的菌落及个体形态特征

2.2.3 菌株EL32的生理生化特征

2.3 小结

第3章 弹性蛋白酶的纯化及结构研究

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.2.1 弹性蛋白酶的硫酸铵分级沉淀

3.2.2 弹性蛋白酶的离子交换和分子筛层析分离纯化

3.2.3 菌株EL32弹性蛋白酶的SDS-PAGE凝胶电泳分析结果

3.2.4 菌株EL32弹性蛋白酶的肽指纹图谱分析结果

3.2.5 菌株EL32弹性蛋白酶的基因及一级结构

3.2.6 菌株EL32弹性蛋白酶的三维结构

3.3 小结

第4章 菌株EL32弹性蛋白酶的酶学性质及应用探索

4.1 材料与方法

4.2 结果与讨论

4.2.1 菌株EL32弹性蛋白酶的最适pH值和酸碱稳定性

4.2.2 菌株EL32弹性蛋白酶的最适作用温度和热稳定性

4.2.3 金属离子和EDTA对菌株EL32弹性蛋白酶的影响

4.2.4 有机溶剂对菌株EL32弹性蛋白酶的影响

4.2.5 菌株EL32弹性蛋白酶水解刚果红弹性蛋白和酪蛋白的动力学参数

4.2.6 弹性蛋白酶对牛肉及牛筋的水解效果

4.2.7菌株EL32弹性蛋白酶提取牛蛙皮的胶原蛋白试验结果

4.3 小结

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

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