温度胁迫对贻贝的影响：血细胞变化以及caspase3/7和p38-MAPK的反应

摘要

本贻贝是生活在潮间带的重要生物类群，近年来随着全球气候变暖，贻贝的分布格局也在发生变化。其中温度胁迫对贻贝细胞凋亡的影响及其机制目前尚不清楚。本文利用台盼蓝和中性红检测了它们的血细胞应对温度胁迫后细胞活力和溶酶体稳定性的变化，并用tunel技术和流式细胞仪技术检测了紫贻贝血细胞细胞凋亡的情况；利用 RT-PCR和RACE-PCR技术克隆了厚壳贻贝和紫贻贝caspase3/7和p38-MAPK基因的全长序列并分析了其结构特征；采用了Real-time PCR技术检测了它们的组织表达谱和温度胁迫谱；并检测了温度胁迫后这两种贻贝caspase3/7酶活的表达变化。
　　本研究主要内容包括：⑴厚壳贻贝血细胞活力经2℃、6℃和32℃胁迫后活力显著降低；28℃胁迫影响变化不大。厚壳贻贝血细胞溶酶体稳定性在2℃、6℃、28℃胁迫刺激显著降低；而在28℃胁迫后的回复过程中极显著升高；32℃胁迫刺激后溶酶体稳定性显著升高。与厚壳贻贝血细胞类似，紫贻贝血细胞活力在受到2℃、6℃低温胁迫后活力显著降低；28℃胁迫影响变化不大；32℃胁迫刺激力显著降低。紫贻贝血细胞溶酶体稳定性也表现出与厚壳贻贝类似的趋势。此外低温2℃与6℃胁迫刺激诱导紫贻贝血细胞凋亡细胞显著增多；而高温28℃和32℃对紫贻贝血细胞凋亡细胞数目没有明显的影响。⑵厚壳贻贝caspase3/7全长 cDNA序列1203 bp。3’端与5’端非翻译区长分别为182 bp和106 bp,ORF为915 bp。紫贻贝caspase3/7全长 cDNA序列1231 bp，3’端与5’端非翻译区长分别为193 bp和120 bp，ORF为918 bp。厚壳贻贝caspase3/7 cDNA编码304个氨基酸，紫贻贝caspase3/7 cDNA编码305个氨基酸，两者有有一个共同的casc结构域，厚壳贻贝的在48-302 aa处，紫贻贝的在49-303 aa处。厚壳贻贝caspase3/7基因在血液中表达量最高，紫贻贝caspase3/7基因在在鳃中表达量最高。在厚壳贻贝中，低温2℃胁迫在回复24h时和6℃胁迫回复0h时可引起鳃中caspase3/7基因表达量显著升高；低温2℃和6℃胁迫刺激血液中caspase3/7基因的表达显著升高；此外在厚壳贻贝鳃中，低温2℃胁迫caspase3/7酶活显著降低；低温6°C和高温28°C和32°C胁迫诱导caspase3/7酶活显著升高。低温2℃、6℃、高温28℃和32℃胁迫都能不同程度地刺激厚壳贻贝血液中caspase3/7酶活显著升高。在紫贻贝中：低温2℃、6℃、高温28℃和32℃胁迫都能不同程度地刺激鳃中caspase3/7基因表达显著降低；低温6℃胁迫2h和高温28℃胁迫0h时刺激消化腺中caspase3/7基因的表达显著升高；28℃胁迫0h和32℃胁迫回复0h时血液中caspase3/7基因的表达显著升高。此外在紫贻贝鳃中，低温2℃、6℃、高温28℃和32℃胁迫都能不同程度地刺激caspase3/7酶活显著升高。在紫贻贝血中，低温2℃、6℃和高温28℃都能不同程度地刺激caspase3/7酶活显著升高；32℃胁迫caspase3/7酶活显著降低。⑶厚壳贻贝p38-MAPK全长 cDNA序列1502 bp，3’端与5’端非翻译区长分别为144 bp和296 bp,ORF为1062 bp。紫贻贝p38-MAPK全长cDNA序列1443 bp，3’端与5’端非翻译区长分别为231 bp和150 bp,ORF也是1062 bp。两者都编码353个氨基酸，有共同的结构域S_TKc结构域（26-310 aa）。厚壳贻贝p38-MAPK在血液中表达量最高，而紫贻贝p38-MAPK在鳃中表达量最高。低温6℃胁迫刺激厚壳贻贝鳃和消化腺中p38-MAPK基因的表达显著升高。低温2℃、6℃、高温28℃和32℃胁迫都能不同程度地刺激厚壳贻贝血液中p38-MAPK基因表达显著降低。紫贻贝与厚壳贻贝p38-MAPK温度胁迫谱不相同，具体如下：2℃胁迫刺激紫贻贝鳃中p38-MAPK基因的表达显著升高。低温6℃胁迫2 h和高温28℃胁迫0 h时刺激紫贻贝消化腺中p38-MAPK基因表达量显著升高。高温28℃胁迫0h和32℃胁迫刺激2h时紫贻贝血液中p38-MAPK表达量显著升高。

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第1章 引言

1.1贻贝概况

1.2贻贝的研究现状

1.3温度对海洋生物的影响

1.4细胞凋亡研究进展

1.5本研究的目的及意义

第2章 温度胁迫对厚壳贻贝和紫贻贝血细胞的影响

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3实验结果

2.4讨论

第3章 厚壳贻贝和紫贻贝部分细胞凋亡执行子caspase 3/7 cDNA序列克隆及表达分析

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

第4章 厚壳贻贝和紫贻贝细胞凋亡相关基因p38-MAPK cDNA序列克隆及表达分析

4.1材料与方法

4.2结果

4.3讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

在学期间发表的学术论文