日本囊对虾CathepsinB基因在卵巢发育中的表达研究

摘要

日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）是我国东南沿海重要的经济养殖种类。对虾的性腺发育一直是研究的热点。本实验室已克隆出组织蛋白酶 B（Cathepsin B）的cDNA全长，并发现该基因在卵巢中特异性表达。我们采用实时定量PCR（RT-PCR）、免疫组织化学、Western blot、原位杂交等技术研究了Cathepsin B在日本囊对虾卵巢中不同发育阶段的表达分析。
　　首先采用HE染色，并结合性腺发育指数（gonad-somatic index，GSI）确定日本囊对虾卵巢发育各个期的卵细胞的形态和染色特征，将其划分为四个期，分别为卵黄合成前期（previtellogenic oocyte stage），内源性卵黄合成期（endogenous vitellogenic oocyte stage），外源性卵黄合成期（ exogenous vitellogenic oocyte stage）和成熟期（mature oocyte stage）。
　　采用实时定量PCR技术，以18S rRNA为内标基因，检测日本囊对虾Cathepsin B基因在mRNA水平不同卵巢发育时期的表达。结果显示，Cathepsin B在卵黄合成前期表达最高，内源性卵黄合成期和外源性卵黄合成期表达水平基本一致，而在成熟期表达水平急剧下降。其中卵黄合成前期与其它三期相比具有显著性差异（p<0.05），内源性卵黄合成期和外源性卵黄合成期Cathepsin B不具有显著性差异（p>0.05），而成熟期与前边三期相比具有显著性差异（p<0.05）。
　　而Western blot结果显示Cathepsin B蛋白在卵黄合成前期表达量最低，这与实时定量结果不一致，推测 Cathepsin B的控制机制是转录后调控机制。Western blot实验显示Cathepsin B蛋白的分子大小要比其理论值要大，推测Cathepsin B是一个翻译后调控蛋白。实时荧光定量PCR实验和Western blot都显示Cathepsin B的 mRNA和蛋白表达在成熟期下调，这表明Cathepsin B在卵细胞成熟期的作用可能减弱。
　　原位杂交和免疫组化实验显示Cathepsin B的 mRNA和蛋白质都在卵细胞的细胞质表达，而且免疫组化显示 Cathepsin B蛋白首先出现在离卵细胞的细胞核最近位置。但在成熟期的皮质棒中没有检测到Cathepsin B的mRNA或蛋白的存在。
　　以上实验结果显示Cathepsin B在日本囊对虾卵巢发育过程中可能发挥了重要作用。

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第1章 引言

1.1 日本囊对虾的形态特征、生活习性以及地理分布

1.2 对虾育苗中存在的问题

1.3 日本囊对虾卵巢分期研究

1.4 对虾卵巢发育相关基因研究

1.5 组织蛋白酶B（Cathepsin B）的研究进展

1.6 本研究的主要内容、意义和技术路线

第2章 HE染色和日本囊对虾卵巢分期

2.1 材料与方法

2.2 实验方法

2.3 结果

2.4 讨论

第3章 Cathepsin B 在mRNA水平上的表达研究

3.1 材料

3.2 原位杂交主要试剂配制

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 讨论

第4章 Cathepsin B在蛋白水平上的表达研究

4.1 材料

4.2实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

在学期间发表的学术论文