杂色鲍维甲酸X受体转录激活系统的构建与配体筛选

摘要

维甲酸X受体是核受体超家族的一员，作为配体依赖型转录因子在生物个体发育、细胞分化、新陈代谢和细胞凋亡中发挥重要作用。新近的研究表明，有机锡化合物（如TBT、TPT）导致的腹足类性畸变与RXR密切相关。论文以课题组前期研究克隆的杂色鲍RXR基因序列为基础，构建了杂色鲍RXR转录激活系统，筛选了杂色鲍RXR天然配体和环境配体，并比较了这些化合物对杂色鲍和斑马鱼RXR转录活性影响的差异。
　　本研究主要内容包括：⑴克隆了杂色鲍RXR的编码区并重组至超表达载体pcDNA3.1(+)，构建了重组超表达载体pcDNA3.1(+)-HdRXR。同时在报告基因pGL3-promoter启动子区重组维甲酸X反应元件（RXRE），构建了重组报告基因载体 pGL3-promoter-RXRE。应用质粒共转染技术将重组表达载体 pcDNA3.1(+)-HdRXR和重组报告基因载体 pGL3-promoter-RXRE共转染至293FT细胞，构建了杂色鲍RXR转录激活系统。⑵采用上述构建的杂色鲍RXR转录激活系统，对杂色鲍RXR的天然配体和环境配体进行了筛选。结果显示，9cRA、TBT和TPT分别在浓度为1×10-7 M、1×10-8 M和1×10-7 M时极显著诱导Luc的表达，在1×10-6 M、1×10-7 M和1×10-6 M达到最大值，诱导倍数分别是2.25倍、2.67倍和3.23倍。1×10-8 M的 DHA显著诱导Luc的表达，诱导倍数为1.51倍。这些结果表明TBT和TPT为杂色鲍RXR的环境配体，9cRA和DHA则有可能为杂色鲍RXR的天然配体。⑶构建了斑马鱼 RXR的转录激活系统，并比较了上述化学物质对这两种 RXR转录活性的影响。结果表明，9cRA对斑马鱼RXR的有效浓度是杂色鲍的10倍，TBT是杂色鲍的100倍。TPT对斑马鱼RXR的的有效诱导浓度与杂色鲍相同，但对斑马鱼RXR转录活性的诱导倍数显著低于杂色鲍。DHA对斑马鱼RXR的转录没有显著影响。这些结果表明上述化合物与RXR的结合具有物种特异性。⑷在构建RXR转录激活系统过程中比较了不同的宿主细胞，发现虽然cos-1细胞贴壁紧，能够稳定表达目的基因和报告基因，但293FT细胞转染效率更高，表达时间更短，表达水平相对较高。此外，对于目前应用最广泛的荧光素酶双报告基因体系中的内参海肾荧光素酶，研究发现其在杂色鲍RXR转录激活系统中的表达会随着TBT浓度的增加而增加，提示荧光素酶双报告基因检测系统并不适用于所有的转录激活系统。

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主要符号表

第1章 引言

1.1 维甲酸X受体概述

1.2 维甲酸X受体的天然和环境配体

1.3 转录激活实验

1.4 转录激活实验在环境内分泌干扰物监测中的应用

1.5 转录激活实验在维甲酸X受体干扰物监测中的应用

1.6 主要研究内容和技术路线

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

第3章 实验结果

3.1 总RNA提取结果

3.2 RXR开放阅读框（ORF）扩增结果

3.3 重组质粒pcDNA3.1-HdRXR的鉴定

3.4 重组质粒pcDNA3.1-DrRXR的鉴定

3.5 重组质粒pGL3-promoter-RXRE的鉴定

3.6 杂色鲍RXR配体的筛选

3.7 斑马鱼RXR配体的筛选

3.8 不同化合物与杂色鲍和斑马鱼RXR结合的差异

第4章 讨论

4.1杂色鲍RXR转录激活系统的构建

4.2 杂色鲍RXR的可能配体

4.3 RXR与化合物的结合具有种属特异性

第5章 结论与展望

致谢

参考文献

在学期间发表的学术论文及研究成果