两种海洋弧菌快速检测试纸条的研制及应用

摘要

弧菌广泛存在于海水、沉积物及海洋动物体中，是海水鱼、虾、贝类的一种常见致病菌，也是引起人类急性肠胃炎的主要病原微生物，对人类身体健康造成很大威胁。而目前检测海洋弧菌的方法存在耗时长，过程繁琐等缺点，无法满足海产品的监测需要。因此需要研制出一种耗时短、操作简单的快速检测方法。
　　胶体金免疫层析技术(GICA)是九十年代以来新发展起的一种快速检测技术，并已应用在许多方面的检测。其耗时短、操作简单、特异性强等特点，使其在现代食品检测工作中发挥重要作用。
　　本实验用甲醛灭活法制备副溶血性弧菌(Vp)和霍氏格里蒙菌(Gh)全菌抗原并免疫新西兰大白兔，得到多克隆抗体血清，并使用辛酸-硫酸铵盐析法进行纯化，得到Vp全菌抗体、Gh全菌抗体1和抗体2，经ELISA法测定其效价分别为:1∶32000、1∶64000、1∶16000，Bradford法测定抗体浓度分别为21.06、19.20、19.11mg/mL，经SDS-PAGE鉴定抗体纯度较好，可为后续试验所用。
　　本实验采用柠檬酸三钠法制备20nm粒径的胶体金，并用于标记抗体，确定Vp多抗和Gh多抗1的最佳蛋白标记量分别为27.6μg、21.6μg;选择金标探针稀释液配方为:0.01mol/L Tris-HCL（1％ BSA、0.5％ PEG20000、5％蔗糖、0.5％ Tween-20），样品垫处理液配方为:0.01 mol/L的PB溶液（1％ BSA、1％蔗糖、0.5％ Triton-100、1％ tween-20）;组装成试纸条后，Vp试纸条的灵敏度为103 cfu/ml，Gh试纸条的灵敏度为105 cfu/ml;经测试，两种试纸条均具有较好的特异性与稳定性，室温下可保存90 d;当样品中含有杂菌时，检测灵敏度不受影响。
　　本实验建立了免疫磁珠分离富集目的菌的方法，确定最佳免疫磁珠用量为60μL，最佳捕获时间为30min。并将离心富集与免疫磁珠富集方法对试纸条灵敏度的提升情况作了对比;GICA直接检测明虾、海蛎、花蛤、鱿鱼样品中的Vp时，灵敏度可达105 cfu/ml;检测人工污染明虾、海蛎样品（4 cfu/g）时，经8h增菌即可检出;直接检测海蛎样品中Gh时，灵敏度为106 cfu/mL; IMS-GICA联合检测海蛎样品中Vp时，灵敏度为104 cfu/mL，联合检测样品中Gh时，灵敏度为105 cfu/mL.

目录

声明

摘要

主要符号表

第1章 引言

1．1 副溶血性弧菌

1．1．1 副溶血性弧菌形态和生化特性

1．1．2 副溶血性弧菌的危害及致病机制

1．1．3 副溶血性弧菌检测方法研究进展

1．2 霍氏格里蒙菌

1．2．1 霍氏格里蒙菌形态和生化特性

1．2．2 霍氏格里蒙菌的危害及致病机制

1．2．3 霍氏格里蒙菌检测方法的研究进展

1．3 胶体金免疫层析技术

1．3．1 胶体金概述

1．3．2 胶体金标记抗体

1．3．3 胶体金免疫层析技术原理

1．3．4 胶体金免疫层析技术优势

1．4 论文主要研究目的、内容和创新点

1．4．1 研究目的

1．4．2 研究内容

1．4．3 创新点

2．1 实验材料

2．1．1 菌株

2．1．2 药品试剂

2．1．3 溶液配制

2．1．4 仪器设备

2．2 方法

2．2．1 弧菌的培养

2．2．2 全茵抗原的制备

2．2．3 多克隆抗体的制备

2．2．4 多克隆血清的纯化

2．2．5 透析袋的处理与保存

2．2．6 间接ELISA法分析纯化前后兔多抗的效价

2．2．7 Bradford法测定纯化前后兔多抗的蛋白浓度

2．2．8 SDS-PAGE蛋白电泳检测纯化后抗体纯度

2．3 结果

2．3．1 菌落特征分析

2．3．2 效价测定结果分析

2．3．3 多克隆血清蛋白浓度测定结果

2．3．4 SDS-PAGE分析纯化后血清

2．4 讨论

2．4．1 多克隆抗体的制备

2．4．2 多克隆抗体的纯化

2．4．3 多克隆抗体蛋白浓度测定

2．5 本章小结

3．1．1 菌株

3．1．2 药品试剂

3．1．3 仪器设备和耗材

3．1．4 溶液配制

3．2 实验方法

3．2．1 玻璃器皿的清洗

3．2．2 不同柠檬酸三钠加入量的胶体金溶液制备

3．2．3 胶体金溶液的鉴定与分析

3．2．4 金标探针的制备

3．2．5 试纸条的组装

3．2．6 试纸条的性能测试

3．3 结果分析

3．3．1 不同柠檬酸三钠加入量的比较分析

3．3．2 金标探针的制备与鉴定

3．3．3 试纸条的组装

3．3．4 试纸条的性能测试结果

3．4 讨论

3．4．1 胶体金的制备

3．4．2 胶体金的保存

3．4．3 金标探针的制备

3．4．4 金标探针的纯化

3．4．5 金标探针的稀释

3．4．6 试纸条的假阳性

3．4．7 试纸条灵敏度影响因素

3．4．8 试纸条的保存

3．5 本章小结

第4章 Gh快速检测试纸条的研制

4．2．1 金标探针的制备

4．2．2 试纸条的组装

4．2．3 试纸条的性能测试

4．3 结果分析

4．3．1 金标探针的制备与鉴定

4．3．2 试纸条的性能测试结果

4．4 本章小结

第5章 免疫磁珠联合试纸条检测方法的建立及应用

5．1 实验材料

5．1．1 药品试剂

5．1．2 样品

5．1．3 溶液配制

5．2 实验方法

5．2．1 免疫磁珠制备

5．2．2 免疫磁珠富集目的菌的条件优化

5．2．3 免疫磁珠与目的菌的分离

5．2．4 免疫磁珠特异性分析

5．2．5 免疫磁珠结合试纸条检测样品

5．3 结果分析

5．3．1 最佳磁珠用量

5．3．2 最佳菌体捕获时间

5．3．3 Vp样品检测结果

5．3．4 Gh检测结果

5．3．5 免疫磁珠特异性分析

5．4 讨论

5．4．1 免疫磁珠偶联抗体

5．4．2 影响免疫磁珠富集目的菌能力的因素

5．5 本章小结

第6章 结论与展望

致谢

参考文献