嗜酸硫化芽孢杆菌苯酚羟化酶还原酶组分的重组表达与性质研究

摘要

细菌多组分单加氧酶（BMMOs）是一类具有非血红素双铁中心的，可利用分子氧降解一系列有机物的多组件酶系统。BMMOs通常含有三个组件：羟化酶组件，还原酶组件和调节蛋白。其中还原酶组分通常是一个含有黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和[2Fe-2S]铁硫簇的酶，负责将电子通过辅基从NAD(P)H传递给羟化酶的双铁中心，是电子传递链上最关键的蛋白。多组分苯酚羟化酶是BMMO家族的一个重要成员，它可以将苯酚羟化成低毒的中间物质，因此在污染物苯酚的降解中发挥重要的作用。一株中等嗜热的革兰氏阳性嗜酸硫化芽孢杆菌TPY（Sulfobacillus acidophilus）可以降解苯酚，并且具有编码多组分苯酚羟化酶的基因簇mhpLMNOP。为了探索Sulfobacillus acidophilus TPY的多组分苯酚羟化酶，本项工作从苯酚羟化酶的还原酶组分MhpP入手进行，进行功能和特性研究。
　　序列分析结果显示MhpP具有含铁硫簇结合的保守位点的N端铁氧还蛋白（ferredoxin）-like结构域和C端含FAD和NADPH结合位点的铁氧还蛋白还原酶（FNR）-like结构域，这是典型的细菌多组分单加氧酶还原酶结构。在一些保守基序上MhpP也有自己的特点。MhpP在亲缘关系上亲近于一些苯酚降解菌的苯酚羟化酶的还原酶组分，但是与这些蛋白的序列相似度却低于50％。这些特点证明了S.acidophilus TPY的MhpP作为苯酚羟化酶还原酶组分的序列新颖性。MhpP在大肠杆菌中异源表达，纯化得到的重组蛋白经过紫外-可见光（UV-vis）光谱扫描，电子顺磁共振扫描（EPR），以及薄层层析（TLC）检测，证明MhpP含有FAD辅基和[2Fe-2S]辅基。MhpP可以氧化NADPH，并还原三种电子受体：细胞色素c，铁氰化钾，氯化硝基四氮唑蓝（NBT）。底物专一性检测结果显示MhpP在NADPH和NADH之间严格偏好于NADPH为电子供体。对N端结构域与[2Fe-2S]铁硫簇结合有关的四个保守半胱氨酸残基的定点突变影响了蛋白对铁硫簇的结合，进而导致了酶对NADPH的氧化能力下降。MhpP以FAD和[2Fe-2S]辅基，能氧化NADPH和传递电子，证明了自己作为BMMO系统中还原酶的能力。这是首次对Sulfobacillus acidophilus菌中苯酚羟化酶组分的表达和特性研究，也为进一步研究Sulfobacillus acidophilus.TPY中苯酚降解系统的其他酶奠定了基础。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

缩写词表(abbre viations)

目录

第一章 绪论

1.1 细菌多组分单加氧酶

1.2 苯酚羟化酶

1.3 本论文的研究目的和意义

1.4 本论文研究总体方案

第二章 嗜酸硫化芽孢杆菌TPY苯酚羟化酶还原酶组分的序列分析

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.4 小结

第三章 苯酚羟化酶还原酶组分的重组表达与辅基鉴定

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.4 小结

第四章 苯酚羟化酶还原酶组分的功能鉴定与酶活测定

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与讨论

4.4 小结

第五章 苯酚羟化酶还原酶组分的定点突变

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 结果与讨论

5.4 小结

结语

主要成果

创新点

展望

参考文献

主要研究成果

致谢

附件：专利申请书