葛根素对经IL-1β诱导的大鼠软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响

摘要

目的:
　　本实验应用细胞及分子生物学技术，通过研究葛根素对经IL-1β诱导的大鼠软骨细胞中Ⅱ型胶原的影响，探讨其调节软骨细胞增殖，保护软骨细胞，防治骨关节炎的作用机制，为临床中使用中药葛根治疗骨关节疾病提供实验基础与理论依据。
　　方法:
　　1.软骨细胞体外培养体系的建立与鉴定:原代细胞应用联合酶消化法从4周龄SD大鼠关节软骨获取，并以倒置显微镜下的形态学表现及甲苯胺蓝染色进行鉴定;
　　2.MTT法检测不同浓度的IL-1β对大鼠软骨细胞的影响，筛选适宜的诱导浓度;
　　3.MTT法检测不同浓度的葛根素对大鼠软骨细胞增殖的影响，筛选最佳干预浓度;
　　4.采用RT-PCR观察葛根素对IL-1β诱导后软骨细胞COL-Ⅱ的基因表达的影响;
　　5.WesternBlot检测葛根素对IL-1β诱导后软骨细胞COL-Ⅱ的蛋白表达的影响。
　　结果:
　　1.采用联合酶消化方法建立大鼠软骨细胞体外培养体系，经倒置显微镜下形态学观察及甲苯胺蓝染色鉴定，与甲苯胺蓝染色呈异染，确认分离培养的是软骨细胞，软骨细胞培养传3代以内可以保持表型的稳定。
　　2.关于不同浓度IL-1β诱导后对软骨细胞增殖抑制的变化，以10ng/mlIL-1β诱导48h时对软骨细胞增殖的抑制作用最强。对软骨细胞增殖影响的观察显示:葛根素50、100、200μmol/L均可促进正常培养软骨细胞的增殖，且增殖效应随药物浓度的增加而递增，在第48h时，对于正常培养的软骨细胞，200μmol/L葛根素组促进软骨细胞的增殖作用最佳，与对照组比较有显著差异(P＜0.05）。
　　3.RT-PCR结果显示:四组的mRNA扩增产物中都能看到预期长度的Ⅱ型胶原特异性条带。经IL-1β干预组表达明显减弱，与正常组相比有显著性差异(P＜0.05);Pue组表达明显增强，与正常组、10ng/mlIL-1β组相比有显著性差异(P＜0.05);10ng/mLIL-1β+200μmol/LPue组与10ng/mlIL-1β组相比表达明显增强，有显著性差异(P＜0.05)，与正常组mRNA表达无显著性差异(P＞0.05)。
　　4.WesternBlot结果显示:正常情况下，软骨细胞中表达COL-2蛋白，而加入10ng/mLIL-1β后，COL-Ⅱ蛋白表达明显减弱，其差别具有显著性意义（P＜0.05）;而200μmol/LPue组能显著上调COL-Ⅱ蛋白表达（P＜0.05）。加入200μmol/LPue干预经10ng/mLIL-1β诱导后的大鼠软骨细胞可显著上调被抑制的COL-Ⅱ蛋白表达，与10ng/mLIL-1β组比较有显著性差异（P＜0.05），而与正常组的蛋白表达无明显差异（P＞0.05）。
　　结论:
　　1.IL-1β能够抑制正常培养的大鼠软骨细胞的增殖，且与剂量呈正相关。
　　2.葛根素能够促进正常培养的大鼠软骨细胞的增殖，且与剂量呈正相关。
　　3.葛根素能够有效阻止IL-1β对大鼠软骨细胞合成的Ⅱ型胶原在基因表达和蛋白表达的抑制作用。这可能是葛根素有效保护软骨细胞，抵御炎症因子侵蚀，防治骨关节疾病的机制之一。

目录

声明

摘要

前言

第一章 材料与方法

1 材料

1．1 实验动物

1．2 主要试剂及配置方法

1．3 主要仪器设备

2 实验方法

2．1 酶消化法分离培养大鼠软骨细胞

2．2 大鼠软骨细胞的传代培养

2．3 软骨细胞的形态学观察及甲苯胺蓝染色鉴定细胞表型

2．4 MTT法检测不同浓度IL-1β对大鼠软骨细胞增殖的影响

2．5 MTT法测定不同浓度葛根素对大鼠软骨细胞增殖的影响

2．6 葛根素对经IL-1β诱导的SD大鼠软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达的影响

2．7 Western Blot检测葛根素干预后细胞内COL-2蛋白表达水平

第二章 结果

1 软骨细胞的形态观察

2 软骨细胞经甲苯胺蓝染色后观察

3 不同浓度IL-1β对软骨细胞增殖的影响(-X±S)

4 不同浓度葛根素对软骨细胞增殖的影响(-X±S)

5 葛根素对IL-1β诱导的大鼠软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达的影响

6 葛根素对IL-1β诱导的SD大鼠软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白表达的影响

第三章 讨论

1 软骨细胞的体外培养

2 IL-1β在骨关节炎发病中的作用及模型的选用

3 葛根素的应用与防治骨关节炎的前景

结论

参考文献

致谢

文献综述 中药单体与骨关节炎软骨细胞凋亡的研究进展

作者简历