壮骨健膝方对IL-1β诱导后大鼠软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原表达影响的研究

摘要

目的： 通过对比观察壮骨健膝方及壮骨关节丸含药血清对IL-1β诱导后关节软骨细胞增殖、Ⅱ型胶原蛋白及其mRNA表达的影响，探讨壮骨健膝方对损伤的关节软骨细胞的保护效应。 方法： 1．软骨细胞体外培养体系的建立与鉴定：原代细胞应用联合酶消化法从4周龄SD大鼠关节软骨获取，并以倒置显微镜下的形态学表现及甲苯胺蓝染色进行鉴定。 2．MTT比色法观察壮骨健膝方及壮骨关节丸含药血清对正常和IL-1β诱导后软骨细胞增殖的影响； 3．免疫组化法观察壮骨健膝方及壮骨关节丸含药血清对正常和IL-1β诱导后软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响； 4．RT-PCR法观察壮骨健膝方及壮骨关节丸含药血清对正常和IL-1β诱导后软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达的影响。 结果： 1．采用联合酶消化方法建立大鼠软骨细胞体外培养体系，经倒置显微镜下形态学观察及甲苯胺蓝染色鉴定，确认分离培养的细胞符合软骨细胞的生物学特征。形态学、组织化学染色显示软骨细胞培养传3代以内可以保持表型的稳定。 2．对软骨细胞增殖的观察显示：壮骨健膝方（ZGJXF）5%、10%、20%的含药血清浓度均可促进正常培养软骨细胞的增殖，但增殖效应不随血清浓度的增加而呈比例递增，其中10%血清浓度组在第48h时促进软骨细胞的增殖作用最佳。在第48h时，对于正常培养的软骨细胞，10% ZGJXF含药血清组与10%空白血清组比较有显著差异（P<0．05），但与10%壮骨关节丸含药血清组比较无统计学差异（P>0．05）；各组细胞的增殖效应在第48h时均强于第72h时。关于不同浓度IL-1β诱导后软骨细胞增殖的变化，以10ng/mlIL-1β诱导48h时对软骨细胞增殖的抑制作用最强。关于含药血清对IL-1β诱导后软骨细胞增殖变化的影响，在第48h时，10% ZGJXF含药血清能有效阻断IL-1β对软骨细胞增殖的抑制作用，10% ZGJXF含药血清+10ng/mlIL-1β组与10%空白血清+10ng/mlIL-1β组比较有统计学差异（P<0．05），但与10%壮骨关节丸含药血清+10ng/mlIL-1β组比较无统计学差异（P>0．05）。 3．免疫组织化学结果显示：各组标本均可见Ⅱ型胶原阳性表达，表达部位为胞浆，可见红棕色颗粒或成片状。空白+IL-1β组较空白组的Ⅱ型胶原表达显著减弱（P<0．05）；ZGJXF+IL-1β组与空白+IL-1β组的Ⅱ型胶原表达的对比有明显增强（P<0．05），但与壮骨关节丸+IL-1β组表达的比较无明显差异（P>0．05）； ZGJXF组与空白组的Ⅱ型胶原表达比较有显著差异（P<0．05），但与壮骨关节丸组比较无明显差异（P>0．05）。 4． RT-PCR结果：六组的mRNA扩增产物中都能看到预期长度的Ⅱ型胶原特异性条带。空白+IL-1β组较空白组的Ⅱ型胶原mRNA表达显著减弱（P<0．05）； ZGJXF+IL-1β组较空白+IL-1β组的Ⅱ型胶原mRNA表达明显上调（P<0．05），但ZGJXF+IL-1β组与壮骨关节丸组+IL-1β组Ⅱ型胶原mRNA表达比较无明显差异（P>0．05）。ZGJXF组与空白组的Ⅱ型胶原mRNA表达比较有显著差异（P<0．05），但与壮骨关节丸组比较无统计学差异（P>0．05）。 结论： 壮骨健膝方对正常及IL-1β诱导后软骨细胞均有良好促进增殖的作用；壮骨健膝方能有效阻止IL-1β对软骨细胞合成的Ⅱ型胶原蛋白在转录和翻译水平的抑制效应。提示壮骨健膝方对关节软骨具有保护作用，这可能是该方防治骨性关节炎的机制之一。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

实验一SD大鼠关节软骨细胞的体外分离与培养

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

实验二壮骨健膝方对IL-1β诱导后SD大鼠软骨细胞增殖的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

实验三壮骨健膝方对IL-1β诱导后SD大鼠软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

实验四壮骨健膝方对IL-1β诱导后SD大鼠软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

结语

1论文小结

2展望

参考文献

附图

致谢

附录综述：中药对骨性关节炎细胞因子影响的研究进展

作者简历