基于Rho/Rock信号转导通路研究透骨消痛胶囊对骨性关节炎软骨退变的影响

摘要

目的：
　　探讨透骨消痛胶囊对关节软骨退变Rho/Rock信号转导通路的影响，以阐明其治疗骨性关节炎的部分作用机制。
　　方法：
　　1.采用4％木瓜蛋白酶注射建立大鼠膝骨性关节炎模型，随机分为正常组，模型组，对照组，透骨消痛胶囊大、中、小剂量组，给药8周后，收集大鼠右侧膝关节软骨，光镜和电镜检查软骨组织的形态学变化，TUNEL检测软骨细胞凋亡情况，免疫组化检测软骨细胞Rho/Rock信号转导通路上RhoA、Rac1、Cdc42及Rock1等蛋白的表达。
　　2.建立软骨细胞体外培养体系，甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原染色鉴定软骨细胞。倒置显微镜观察软骨细胞的形态，MTT检测第2-4代软骨细胞的生长曲线。
　　3.F2软骨细胞培养72 h后，随机分为空白组、TNF-α组、透骨消痛胶囊组，除空白组外，分别加入20 ng/ml的TNF-α干预4h后，透骨消痛胶囊组换为不同浓度的药液作用24 h。MTT检测软骨细胞活性，DAPI染色检测细胞的凋亡情况，流式细胞仪检测软骨细胞凋亡和线粒体膜电位，RT-PCR及Western blot观察软骨细胞Rho/Rock信号转导通路上RhoA、Rac1、Cdc42及Rock1等基因和蛋白的表达。
　　结果：
　　1.透骨消痛胶囊对大鼠骨性关节炎模型关节软骨的大体外观、HE染色、软骨超微结构均有明显改善，TUNEL结果显示其降低软骨细胞凋亡指数，免疫组化结果显示透骨消痛胶囊下调了RhoA、Rac1、Cdc42、Rock1、PKN、ERK6、MKK3及TNF-α蛋白表达，上调了软骨细胞功能基因Cbfα1、CollagenⅡ和SOX-9的蛋白表达，与模型组比较，有显著性差异。
　　2.F2软骨细胞甲苯胺蓝染色，胞浆内呈紫红色异染颗粒，Ⅱ型胶原染色可见细胞胞浆异染为棕黄色颗粒，呈片状或团块状。F1-F3软骨细胞，细胞生长曲线呈典型的倒“S”形。第3-6天为对数生长期，选择F2软骨细胞铺板后6d内进行实验。
　　3.20 ng/ml TNF-α干预4h为诱导细胞凋亡的最佳作用浓度和时间，500μg/ml，100μg/ml，20μg/ml三个浓度，干预24 h为透骨消痛胶囊有效作用浓度和时间。各组干预后，透骨消痛胶囊组软骨细胞形态明显好于TNF-α组，凋亡细胞减少，存活率明显高于TNF-α组(P＜0.01);减少软骨细胞的晚期凋亡率，提高了线粒体膜电位，保护了线粒体损伤，能不同程度地下调RhoA、Rac1、Cdc42、Rock1、PKN、ERK6、MKK3、TNF-α和Bax基因和蛋白表达，上调Cbfα1和Bcl-2的表达，上调了Bcl-2/Bax蛋白比值，与模型组比较，有显著性差异。
　　结论：
　　透骨消痛胶囊可通过抑制Rho/Rock信号通路上重要因子的信号转导，减少软骨细胞的凋亡数目，改善软骨细胞形态，减轻软骨破坏，促进软骨细胞代谢及软骨修复，维持软骨结构的相对完整，从而延缓关节软骨退变。

目录

声明

英文缩略词表

摘要

前言

第一部分 透骨消痛胶囊对SD大鼠骨性关节炎Rho／Rock信号转导通路的影响

1 研究目的

2 实验材料

2．1 实验药物

2．2 实验动物

2．3 主要试剂

2．4 主要仪器

3 实验方法

3．1 实验分组及动物模型制备

3．2 药物剂量设置

3．3 给药方法

3．4 动物取材

3．5 大体观察

3．6 HE染色观察组织形态

3．7 TUNEL检测软骨细胞调亡

3．8 透射电镜观察软骨细胞凋亡情况

3．9 免疫组化染色法观察组织中Rho／Rock通路相关蛋白的表达

3．10 数据统计与分析

4 实验结果

4．1 动物模型鉴定结果

4．2 一般观察

4．3 HE染色结果

4．4 TUNEL凋亡结果

4．5 透射电镜超微结构结果

4．6 免疫组化染色结果

5 讨论

5．1 OA造模方法的选择

5．2 透骨消痛胶囊对膝OA组织形态的影响

5．3 Rho／Rock信号转导通路与OA

6 小结

第二部分 透骨消痛胶囊对软骨细胞Rho／Rock信号转导通路的影响

1 研究目的

2 实验材料

2．1 实验药物

2．2 实验动物

2．3 主要仪器

2．4 主要试剂

2．5 主要试剂的配制

3 实验方法

3．1 软骨细胞体外培养及传代

3．2 软骨细胞的鉴定

3．3 MTT法检测软骨细胞的生长曲线

3．4 建立TNF-α诱导大鼠软骨细胞凋亡模型

3．5 MTT检测梯度浓度法优化透骨消痛胶囊干预软骨细胞凋亡模型的量效关系和时效关系

3．6 透骨消痛胶囊干预软骨细胞凋亡模型的方法

3．7 MTT法检测透骨消痛胶囊对软骨细胞存活率的影响

3．8 采用DAPI染色法观察软骨细胞的凋亡情况

3．9 流式细胞仪检测各组软骨细胞的Annexin-Ⅴ-FITC／PI

3．10 流式细胞仪检测各组软骨细胞线粒体膜电位的变化

3．11 RT-PCR测定各组软骨细胞Rho／Rock通路相关基因表达

3．12 Western Blot测定各组软骨细胞Rho／Rock通路相关蛋白表达

3．13 统计学处理

4 实验结果

4．1 倒置显微镜下观察各代软骨细胞的形态学变化及生长情况

4．2 软骨细胞表型的鉴定结果

4．3 第2、3、4代软骨细胞的生长曲线

4．4 TNF-α诱导软骨细胞凋亡模型的复制及鉴定

4．5 建立透骨消痛胶囊干预软骨细胞凋亡模型的量效关系和时效关系

4．6 透骨消痛胶囊干预后各组软骨细胞的形态学观察

4．7 透骨消痛胶囊干预后各组软骨细胞的存活率

4．8 透骨消痛胶囊干预后各组软骨细胞的Annexin-Ⅴ-FITC／PI的情况

4．9 透骨消痛胶囊干预后各组软骨细胞线粒体膜电位的变化

4．10 各组软骨细胞Rho／Rock通路相关基因表达

4．11 各组软骨细胞Rho／Rock通路相关蛋白表达

5 讨论

5．1 软骨细胞的培养与鉴定

5．2 TNF-α诱导软骨细胞凋亡模型的复制

5．3 Rho／Rock通路调控软骨细胞凋亡的作用机制

5．4 透骨消痛胶囊干预软骨细胞Rho／Rock通路的作用机制

6 小结

总结与分析

结论

参考文献

致谢

文献综述 Rho／Rock信号转导通路与骨性关节炎

作者简历