水飞蓟宾对乳腺癌侵袭转移的抑制作用研究

摘要

目的:Twist基因在恶性肿瘤细胞上皮-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)中发挥重要作用。本研究选用MDA-MB-231和4T1乳腺癌细胞系和小鼠乳腺癌肝肺转移模型，研究Twist基因和EMT相关标志物波形蛋白(Vimentin)和E钙粘蛋白(E-cadherin)在体内外的表达，探讨水飞蓟宾是否是通过影响Twist基因的表达来调控MDA-MB-231和4T1乳腺癌细胞系发生EMT，进而明确其对恶性乳腺癌肿瘤侵袭转移能力的影响。
　　方法:
　　1.体外实验:采用具有高转移性的MDA-MB-231和4T1细胞研究水飞蓟宾对两乳腺癌细胞EMT的影响。培养人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和小鼠乳腺癌细胞系4T1，采用MTT法检测水飞蓟宾对细胞增殖能力的影响;通过细胞划痕实验检测水飞蓟宾对细胞迁移能力的影响，采用Transwell小室法检测水飞蓟宾对细胞迁移与侵袭能力的影响，分别采用RT-PCR与Western blot检测水飞蓟宾对乳腺癌细胞Twist基因与E钙粘蛋白和波形蛋白表达水平的影响。
　　2.体内实验:在BABL-c小鼠第四乳腺对接种4T1细胞建立乳腺癌肝肺转移模型。根据肿瘤的体积分层后，将小鼠随机分成空白对照组、水飞蓟宾低剂量组(50mg/kg)、中剂量组（100mg/kg）、高剂量组（200mg/kg），每组8只。水飞蓟宾经腹腔注射，每天一次，连续两周，空白对照组给予同等体积的生理盐水。末次给药的次日取肿瘤及肝、肺组织，通过瘤体积与瘤重评价水飞蓟宾对移植瘤生长的影响，通过肉眼观察和常规HE染色检测水飞蓟宾对肿瘤转移的影响，采用Western Blot检测水飞蓟宾对E钙粘蛋白和波形蛋白表达的影响。
　　结果:
　　1.体外实验:MTT检测结果显示不同浓度水飞蓟宾(25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml)干预后，50-200μg/ml范围内的水飞蓟宾可以不同程度地抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231和小鼠乳腺癌细胞4T1的增殖，并呈现时间和剂量依赖性。根据MTT检测结果，其余细胞实验均选择50-200μg/ml范围内的水飞蓟宾干预细胞24h进行检测。细胞划痕和Transwell小室法实验结果均显示，水飞蓟宾干预后，MDA-MB-231细胞的迁移与侵袭能力均减弱，且随药物剂量的增大而更弱，对4T1细胞而言，划痕实验能表明水飞蓟宾可以抑制该细胞的迁移，但是在Tranwell迁移与侵袭实验中对照组和各用药组的4T1细胞均不能透过Transwell的微孔膜。RT-PCR检测结果显示，4T1细胞经不同浓度水飞蓟宾干预后，与对照组相比，Twist基因的相对表达量均降低（*p＜0.05）。同样的MDA-MB-231细胞，在药物干预后，Twist基因的相对表达量也不同程度的降低(p＜0.05)，于高剂量时降低的最为显著。Western Blot检测结果显示，水飞蓟宾干预后，两细胞E钙粘蛋白相对表达量较对照组明显上调(p＜0.05)，波形蛋白相对表达量显著下调(p＜0.05)。
　　2.体内实验结果:腹腔注射低(50mg/kg)、中(100mg/kg)、高(200mg/kg)剂量的水飞蓟宾干预小鼠后，各组的平均瘤重为2.11±0.37g，1.37土0.21g和1.45±0.15g，对照组的平均瘤重为2.18±0.31g，低剂量组与对照组相比瘤重没有差异，而中高剂量组与对照组相比瘤重有显著性差异(p＜0.05)。与对照组相比，各给药组小鼠的瘤体积明显变小(p＜0.05)，说明水飞蓟宾能够抑制4T1移植瘤的生长。水飞蓟宾(50mg/kg，100mg/kg，200mg/kg)干预后，肉眼观察肝肺表面转移的结节数，药物组肝表面结节数分别为:7.09±0.11个，4.76±0.37个，1.03±0.23个，与对照组10.81±0.15个相比，均有显著性差异(p＜0.05);而各药物组的肺结节数分别为:9.24±0.28个，6.58±0.19个，2.21±0.13个，与对照组13.72±0.26个相比，均有显著性差异(p＜0.05);常规HE染色可看出各药物组转移灶的数目及转移灶面积明显减少，说明水飞蓟宾抑制肿瘤的转移。Western Blot检测提示水飞蓟宾干预使肿瘤组织中波形蛋白表达量降低，E钙粘蛋白表达量增加。
　　结论:
　　1.水飞蓟宾可以抑制乳腺癌细胞的增殖，降低细胞活力，抑制细胞移植瘤的生长。
　　2.水飞蓟宾可以下调细胞的Twist基因表达，使E钙粘蛋白表达上调，波形蛋白表达下调，从而抑制EMT转变，有效的抑制了肿瘤的转移能力。

目录

声明

摘要

前言

第一章 水飞蓟宾抑制乳腺癌细胞系侵袭转移的体外实验

1 材料

1．1 细胞系

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

2．方法

2．1 细胞培养

2．2 MTT法检测水飞蓟宾对不同乳腺癌细胞增殖的影响

2．3 细胞划痕实验

2．4 Transwell迁移与侵袭实验

2．5 RT-PCR检测Twist基因的表达

2．6 Western Blot检测E钙粘蛋白和波形蛋白的表达

2．7 统计学分析

3．结果

3．1 水飞蓟宾对细胞增殖的影响

3．2 水飞蓟宾对细胞划痕实验的影响

3．3 水飞蓟宾对细胞迁移与侵袭能力的影响

3．4 RT-PCR检测水飞蓟宾对Twist基因表达的影响

3．5 Western Blot检测水飞蓟宾对E钙粘蛋白和波形蛋白表达的变化

4．讨论

第二章 水飞蓟宾抑制乳腺癌侵袭转移的体内实验

1 材料

1．1 细胞系

1．2 动物

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器

2．方法

2．1 小鼠乳腺癌模型建立与分组

2．2 标本收集与处理

2．3 小鼠转移指标的观测

2．4 病理切片和HE染色

2．5 Western Blot检测E钙粘蛋白和波形蛋白的表达

2．6 统计学分析

3．结果

3．1 水飞蓟宾对细胞移植瘤生长的影响

3．2 水飞蓟宾对肿瘤转移的影响

3．3 组织病理形态学观察

3．4 Western Blot检测E钙粘蛋白和波形蛋白的表达

4、讨论

结论

参考文献

附录

致谢

文献综述 上皮-间质转化与转录因子Twist在乳腺细胞癌发生发展中的作用

作者简历