介孔碳纳米粒的表面修饰及其生物相容性研究

摘要

在生物医药领域众多具有应用前景的纳米材料中，碳基纳米材料占据着重要的地位，如碳纳米管、石墨烯和介孔碳材料等，其中介孔碳纳米材料是一类新型具有较大应用潜能的多孔碳纳米材料。它具有大的比表面积和孔容，能提供高的载药能力;具有可调的孔径结构和孔隙，可以控制内装药物分子的释放，在药物传送系统领域有较好的应用前景，然而在用于临床之前，必须充分了解纳米材料的物理化学性质和不良的生理反应，仔细的评估毒性和生物相容性。前期研究中本课题组成功制备了PEG修饰的氧化介孔碳纳米粒作为抗肿瘤药物阿霉素(DOX)的载体，该纳米粒具有良好的亲水性和很高的载药量，DOX的释放具有pH响应性，同时在体内外具有良好的抗肿瘤活性。其他已有的研究也表明，在碳纳米材料表面修饰或嫁接某些亲水性分子如聚乙二醇(PEG)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，可改善碳纳米材料的分散性和血液稳定性，显著提高载体吸附药物的能力和在循环系统半衰期，避免网状内皮系统的捕获以防止药物在传递过程中的非特异性释放，从而提高碳纳米材料的生物相容性。
　　因此本课题拟在前期工作基础上，用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)对介孔碳纳米粒进行表面修饰，从细胞水平、免疫系统作用和整体动物水平研究修饰前后介孔碳纳米粒的生物相容性，为介孔碳材料未来在临床医药领域的可能应用提供一定的依据。
　　第一章主要介绍了介孔碳纳米粒的合成、表面修饰及相关表征。我们通过低浓度水热合成法成功制备了介孔碳纳米粒，透射电镜等检测表明介孔碳纳米粒为较规则的球形，粒径均一，约为90nm，同时具有良好的有序介观结构。主要依靠介孔碳纳米粒强吸附作用在其表面进行修饰，并通过透射电镜、傅立叶红外光谱、热重分析、核磁、紫外-可见分光光度计和马尔文粒径仪等对修饰前后的介孔碳纳米粒进行了较系统的表征，表明PVP和DSPE-mPEG2000成功的修饰到介孔碳纳米粒的表面，并提高了其在水溶液中的分散性和稳定性。细胞摄取实验结果表明，介孔碳纳米粒可以在较短时间内(2h)被正常细胞或肿瘤细胞摄取。
　　第二章主要是测定了修饰前后介孔碳纳米粒的细胞毒性和对细胞的氧化应激水平的影响。通过CCK-8实验、细胞凋亡实验、活性氧检测等方法测定表明，在低于100μg/ml浓度范围内，MCN、MCN-PVP和MCN-PEG与L929细胞共孵育24h时，MCN表现出轻微的细胞毒性，而PVP和DSPE-mPEG2000对MCN的表面修饰能降低其对L929细胞的毒性;而48h时，不同浓度的MCN细胞存活率有所提高，说明MCN本身对L929细胞的毒性较低。修饰和未修饰的介孔碳纳米粒与HeLa细胞共孵育24h或48h后，均未观察到细胞毒性作用，说明介孔碳纳米粒是相对安全的。细胞凋亡实验结果也表明，修饰和未修饰的介孔碳纳米粒不会诱导L929和HeLa细胞发生凋亡。细胞内ROS水平测定表明，MCN可显著诱导L929和HeLa细胞内ROS的产生，产生ROS量随着纳米粒浓度的增加而增多，但修饰后的介孔碳纳米粒相比未修饰前可显著降低刺激细胞产生ROS的量，降低细胞氧化应激水平和介孔碳纳米粒对细胞的刺激性。
　　第三章我们完成了介孔碳纳米粒的初步免疫毒性评价。100μg/ml的MCN、MCN-PVP和MCN-PEG刺激能够mDCs表面分子CD11c、I-Ab、CD40表达量升高，促进mDCs表型成熟。浓度为100μg/ml时，PVP和DSPE-mPEG2000修饰后介孔碳纳米粒能显著的降低未修饰介孔碳纳米粒刺激小鼠树突状细胞分泌的炎症细胞因子TNF-α和IL-6的水平。在25～100μg/ml浓度范围内，MCN、MCN-PVP和MCN-PEG能诱导T淋巴细胞的凋亡，并且随着纳米粒浓度的增大T淋巴细胞凋亡的越多。高浓度时，对T淋巴细胞有较高的免疫毒性，PVP和DSPE-mPEG2000修饰后没有明显的降低T淋巴细胞的凋亡率。通过生物透射电子显微镜的观察到介孔碳纳米粒通过细胞的内吞进入到RAW264.7细胞，并在细胞质中聚集，作为药物载体可以携带药物穿过细胞膜。修饰和未修饰的介孔碳纳米粒对RAW264.7细胞毒性小，可能由于小鼠巨噬细胞较强的吞噬和降解处理能力有关。
　　第四章介孔碳纳米粒的生物毒性效应初步研究。MCN、MCN-PVP和MCN-PEG浓度在0～100μg/ml范围内均无溶血现象（HR％＜5％），说明介孔碳纳米粒具有良好的血液相容性。连续7天尾静脉注射剂量为0.2ml/10g、浓度为1mg/ml的MCN、MCN-PVP和MCN-PEG后，各器官的组织切片说明纳米粒不会引起小鼠的组织纤维化、变性和坏死等病理性改变。但是在肺组织切片中可以观察到聚齐的介孔碳纳米粒，可能是由于其在体内的血流动力学影响，PVP或DSPE-mPEG2000修饰后的介孔碳纳米粒可以减少在肺的残留量，因为介孔碳纳米粒容易在血管壁沉积，而修饰后的纳米粒分散性提高，提高MCN-PVP和MCN-PEG在血管中的流动性。介孔碳纳米粒不影响小鼠的肝肾功能，也没有激活小鼠的补体C3。
　　以上结果表明，本课题成功制备了介孔碳纳米粒，并成功的将生物相容性的高分子PVP和PEG修饰到介孔碳纳米粒的表面。从细胞水平实验可以得到介孔碳纳米粒本身具有较好的生物相容性，但是对细胞具有一定的刺激性，修饰后介孔碳纳米粒可以提高其生物安全性。介孔碳纳米粒对T淋巴细胞毒性有着剂量依赖性，修饰后没有降低其对T淋巴细胞的毒性。从动物水平实验可以得到修饰前后的介孔碳纳米粒具有良好的生物相容性。本研究为介孔碳纳米粒在临床医药领域的应用提供一定的毒理学理论依据。

目录

声明

摘要

前言

第一章 介孔碳纳米粒的合成、修饰及表征

1 实验材料

1．1 主要仪器设备

1．2 主要材料和试剂

2 实验方法

2．1 介孔碳纳米粒(MCN)的合成

2．2 介孔碳纳米粒的表面修饰

2．3 材料的表征

2．4 分散性评估

2．5 介孔碳纳米粒负载异硫氰酸荧光素(MCN-FITC)的合成

2．6 流式细胞仪检测MCN被L929细胞的吞噬

2．7 荧光显微镜考察HeLa细胞对MCN的摄取

3 结果与讨论

3．1 MCN的合成和表征

3．2 MCN的表面修饰及表征

3．4 流式细胞仪检测MCN被L929细胞的吞噬

3．5 荧光显微镜观察HeLa细胞对MCN的摄取

4 本章小结

第二章 介孔碳纳米粒的细胞毒性研究

1 实验材料

1．1 主要仪器设备

1．2 主要材料和试剂

2 实验方法

2．1 细胞培养

2．3 细胞凋亡实验

2．4 细胞ROS水平的测定

3 结果与讨论

3．1 CCK-8细胞毒性实验结果

3．2 细胞凋亡实验结果

3．3 ROS水平的测定结果

4 本章小结

第三章 介孔碳纳米粒的免疫毒性评价

1 实验材料

1．1主要仪器设备

1．2 主要材料和试剂

2 实验方法

2．1 小鼠树突状细胞(mDCs)的培养

2．2 MCN、MCN-PVP、MCN-PEG对mDCs表面分子表达的影响

2．3 纳米粒刺激mDCs分泌细胞因子的测定

2．4 T淋巴细胞凋亡的测定

2．5 RAW264-7细胞对MCN的摄取

2．6 RAW264-7细胞的CCK-8实验

3 结果与讨论

3．1 纳米粒对mDfs表面分子表达的影响

3．2 纳米粒刺激mDCs分泌细胞因子的检测

3．3 T淋巴细胞凋亡实验

3．4 生物透射电子显微镜观察RAW264-7对MCN的摄取

3．5 CCK-8法评价纳米粒对RAW264-7的细胞毒性

4 本章小结

第四章 介孔碳纳米粒的生物毒性效应初步研究

1 实验材料

1．1 主要仪器设备

1．2 主要材料和试剂

2 实验方法

2．1 体外溶血实验

2．2 小鼠体内组织病理学分析

2．3 小鼠血液生化指标检测

2．4 小鼠补体C3的检测

3 结果与讨论

3．1 溶血试验检测纳米粒的血液相容性

3．3 血液生化指标检测结果

3．4 小鼠血清补体C3的变化

4 本章小结

结论

参考文献

致谢

文献综述

作者简历