温阳补肾方对体外培养破骨细胞活性与凋亡影响的实验研究

摘要

目的:
　　通过温阳补肾方含药血清对破骨细胞TRACP活性、Cathepsin-K基因、MMP-9基因及RANK蛋白表达和凋亡率的影响，探讨温阳补肾方抑制破骨细胞活性及促进其凋亡的机理。
　　方法:
　　1.温阳补肾方含药血清制备:将60只Wistar大鼠随机分为4组（对照组、温阳补肾方低剂量组、中剂量组、高剂量组），每组15只。温阳补肾方低剂量组(4.35g/kg·d)、中剂量组(8.70g/kg·d)、高剂量组(17.40g/kg·d)、对照组用等量生理盐水灌胃。每日早晚各一次，连续灌胃7天。末次灌胃1h后，制备温阳补肾方含药血清，-20℃保存备用。
　　2.40ng/mL RANKL和20ng/mL M-CSF诱导因子联合诱导RAW264.7细胞，2d换液一次。每天用倒置相差显微镜动态观察培养细胞的形态及生长情况，TRAP染色鉴定破骨细胞。
　　3.各组加入温阳补肾方含药血清干预24h、48h后，酶动力法测定各组破骨细胞上清液TRACP值。
　　4.流式细胞术检测各组细胞凋亡率。
　　5.实时荧光定量PCR检测温阳补肾方对破骨细胞Cathepsin-K、MMP-9mRNA表达的影响。
　　6.运用Western-blot法检测破骨细胞中RANK的表达。
　　结果:
　　1.40ng/mL RANKL和20ng/mL M-CSF诱导因子联合诱导RAW264.7细胞后，经TRAP染色鉴定后，可获得成熟破骨细胞。
　　2.与空白对照组相比，温阳补肾方低、中、高剂量组在干预24h、48h时能使细胞上清液TRACP活性降低(P＜0.05);中剂量组低于低剂量组、高剂量组(P＜0.05);低剂量组与高剂量组(P＞0.05)差异无统计学意义。TRACP活性随温阳补肾方低、中、高剂量组含药血清干预时间逐渐降低。
　　3.温阳补肾方低剂量组、中剂量组和高剂量组在早期和晚期凋亡百分率与空白对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。温阳补肾方高剂量组＞中剂量组＞低剂量组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　4.温阳补肾方低剂量组、中剂量组和高剂量组可降低破骨细胞Cathepsin-K基因、MMP-9基因表达，差异有统计学意义(P＜0.05);温阳补肾方中剂量组＜高剂量组＜低剂量组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　5.温阳补肾方低剂量组、中剂量组和高剂量组RANK蛋白表达量与空白对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05);温阳补肾方高剂量组＜中剂量组＜低剂量组，差异有统计学意义(P＜0.05);温阳补肾方中剂量组与低剂量组间差异没有统计学意义(P＞0.05)。
　　结论:
　　1.温阳补肾方能明显抑制破骨细胞活性。对破骨细胞性骨吸收的抑制作用与其降低TRACP活力值，减少Cathepsin-K、MMP-9 mRNA表达密切相关。中剂量组效果最佳。
　　2.温阳补肾方能降低破骨细胞RANK蛋白表达，促进破骨细胞凋亡。高剂量组相对效果最佳。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

前言

实验内容

1 实验材料

1．1 实验药物

1．2 主要实验试剂

1．3 实验动物及细胞株

1．4 主要实验仪器

2 实验方法

2．1 实验动物分组及中药干预

2．2 实验试剂配制

2．3 制备中含药血清

2．4 骨薄片的制备

2．5 破骨细胞诱导培养与观察

2．6 破骨细胞酸性磷酸酶染色鉴定

2．7 骨吸收陷窝观察

2．8 流式细胞术检测各组凋亡率

2．9 细胞上清液TRACP活力检测

2．10 荧光定量法检测备组含药血清对破骨细胞中CtsK、MMP-9基因表达的影响

2．11 破骨细胞RANK蛋白的检测

2．12 统计学处理

2．13 技术路线图

3 实验结果

3．1 活体细胞的动态观察

3．2 TRAP染色

3．3 骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色

3．4 培养24h、48h细胞上清液中TRACP活性值

3．5 各组破骨细胞凋亡率

3．6 CtsK、MMP-9基因表达水平

3．7 Western Blot检测RANK蛋白的表达

4 讨论

4．1 温阳补肾方对于激素性股骨头坏死的治法的中医学理论

4．2 基于激素性股骨头坏死的病机选择破骨细胞

4．3 破骨细胞体外培养体系的建立和鉴定

4．4 本实验研究中药含药血清制备

4．5 温阳补肾方含药血清对体外培养破骨细胞活性的影响

4．6 温阳补肾方对OC分化成熟与凋亡的影响

4．7 不足与展望

结论

参考文献

附录

致谢

文献综述

作者简历