温阳补肾方治疗激素性股骨头坏死的临床观察和影响破骨细胞信号通路的实验研究

摘要

目的：
　　通过临床观察温阳补肾方治疗激素性股骨头坏死的疗效，并观察温阳补肾方含药血清对破骨细胞TRACP活性、Cathepsin-K、MMP-9、RANK基因及培养上清液RANK、RANKL的影响，探讨温阳补肾方对防治激素性股骨头坏死的机理。
　　方法：
　　1、本课题临床研究遵循随机对照原则，对37例激素性股骨头坏死患者进行临床观察，其中治疗组18例，对照组19例。治疗组给予温阳补肾方;对照组给予仙灵骨葆胶囊。服药同时辅助功能锻炼，并避免负重和长距离行走。分别于治疗前、治疗后对患者进行VAS、Harris评分并统计分析。
　　2、温阳补肾方含药血清制备:将60只Wistar大鼠随机分为4组（对照组、温阳补肾方低剂量组、中剂量组、高剂量组），每组15只。温阳补肾方低剂量组(4.35g/kg·d)、中剂量组(8.70g/kg·d)、高剂量组（17.40g/kg·d）、对照组用等量生理盐水灌胃。每日早晚各一次，连续灌胃7天。末次灌胃1h后，制备温阳补肾方含药血清，-20℃保存备用。
　　3、40ng/mL RANKL和20ng/mL M-CSF诱导因子联合诱导RAW264.7细胞，2d换液一次。每天用倒置相差显微镜动态观察培养细胞的形态及生长情况，TRAP染色鉴定破骨细胞。
　　4、各组加入温阳补肾方含药血清干预后，酶动力法测定各组破骨细胞上清液TRACP值。
　　5、实时荧光定量PCR检测温阳补肾方对破骨细胞Cathepsin-K、MMP-9、RANKmRNA表达的影响。
　　6、酶联免疫吸附法检测各组上清液RANK、RANKL含量
　　7、免疫组化法检测破骨细胞中RANK的表达。
　　结果：
　　1、临床观察结果示:温阳补肾方组和对照组均能增加Harris评分中功能评分，温阳补肾方组优于对照组(P＜0.05)，VAS评分、Harris其他各项评分的增加值及疗效方面组间未见明显统计学差异(P＞0.05)。
　　2、40 ng/mL RANKL和20 ng/mL M-CSF诱导因子联合诱导RAW264.7细胞后，经 TRAP染色鉴定后，可获得成熟破骨细胞。
　　3、与空白对照组相比，温阳补肾方低、中、高剂量组在干预24h、48h时能使细胞上清液TRACP活性降低(P＜0.05）;中剂量组低于低剂量组、高剂量组(P＜0.05）;低剂量组与高剂量组(P＞0.05)差异无统计学意义。TRACP活性随温阳补肾方低、中、高剂量组含药血清干预时间逐渐降低。
　　4、实时荧光定量PCR检测结果提示温阳补肾方低剂量组、中剂量组和高剂量组可降低破骨细胞Cathepsin-K基因、MMP-9基因表达，差异有统计学意义(P＜0.05）;温阳补肾方中剂量组＜高剂量组＜低剂量组，差异有统计学意义(P＜0.05）。
　　5、ELISA法检测结果提示温阳补肾方低剂量组、中剂量组和高剂量组培养上清液中RANK含量与空白对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05);温阳补肾方高剂量组＜中剂量组＜低剂量组，差异有统计学意义(P＜0.05）;温阳补肾方中剂量组与高剂量组间差异没有统计学意义(P＞0.05)。温阳补肾方低剂量组、中剂量组和高剂量组上清液中RANKL含量与空白对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05）;温阳补肾方中剂量组＜高剂量组＜低剂量组，三组组间差异没有统计学意义(P＞0.05）。
　　6、免疫组化法提示温阳补肾方可减少RANK表达量，差异有统计学意义(P＜0.05）;温阳补肾方高剂量组＜中剂量组＜低剂量组，差异有统计学意义(P＜0.05）。
　　7、实时荧光定量PCR检测结果温阳补肾方低剂量组、中剂量组和高剂量组可降低RANK基因表达，差异有统计学意义(P＜0.05);温阳补肾方中剂量组＜高剂量组＜低剂量组，差异有统计学意义(P＜0.05);温阳补肾方中剂量组与高剂量组间差异没有统计学意义（P＞0.05）。
　　结论：
　　1、温阳补肾方能有效改善激素性股骨头坏死患者的生活质量，减轻疼痛，疗效确切。
　　2、温阳补肾方能明显抑制破骨细胞活性。对破骨细胞性骨吸收的抑制作用与其降低TRACP活力值，减少Cathepsin-K、MMP-9 mRNA表达密切相关。中剂量组效果最佳。
　　3、温阳补肾方通过下调RANK mRNA和蛋白的表达，降低RANKL表达，减少RANKL与RANK的结合，抑制破骨细胞的活化，阻断其骨吸收活性的发挥。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

前言

第一章 理论探讨

1 现代医学对激素性股骨头坏死的发病机制研究

2 中医学对激素性股骨头坏死的病因病机认识

3 温阳补肾法治则的确立

4 破骨细胞在激素性股骨头坏死过程中的作用

第二章 临床疗效观察

第三章 实验内容

第一部分 温阳补肾方含药血清对破骨细脆骨吸收功能的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

第二部分 温阳补肾方含药血清对破骨细胞信号通路的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

结论

不足与展望

参考文献

附录

致谢

文献综述 激素性股骨头坏死研究述评

作者简历