黄芩提取物对内质网应激参与的小鼠酒精性肝损伤的保护作用

摘要

目的：
　　探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是否参与酒精性肝病的病理生理过程。通过测定黄芩提取物（Scutellaria radix extract,SRE）对急性酒精性肝损伤小鼠作用的有关因子，初步探讨该提取物的护肝作用及内质网应激参与机制，为临床寻找理想的保肝药物提供实验和理论依据。
　　方法：
　　高效液相法鉴定黄芩提取物中有效成分黄芩苷的含量
　　酒精诱导肝损伤动物模型的建立及药物干预雄昆明小鼠60只，分为6组：正常组、模型组、硫普罗宁阳性对照组(30mg/kg)、SRE干预组（40、80及160mg/kg)，10只一组。硫普罗宁和 SRE均混悬于0.5％的羧甲基纤维素钠(Sodium carboxymethyl cellulose,CMC-Na)溶剂，以每天灌胃的方式给药。上午9时，药物干预组小鼠分别以30mg/kg的硫普罗宁以及40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg的SRE灌胃，其它组给予0.5%CMC-Na灌胃，均每天1次。除正常小鼠予蒸馏水，剩余小鼠均在每日下午3点用50%的酒精10ml/kg灌胃1次，连续14 d。
　　衣霉素诱导内质网应激动物模型的建立及药物干预雄昆明小鼠70只，分为7组：正常组，二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）对照组，模型组，硫普罗宁阳性药组(30mg/kg)，SRE干预组（40、80及160mg/kg)，一组10只。衣霉素溶于DMSO,其它药物均混悬于0.5%CMC-Na，以每天灌胃的方式给药。上午9时，药物干预组小鼠分别以40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg的SRE以及30mg/kg的硫普罗宁灌胃，其它组给予0.5%CMC-Na灌胃，每天1次，连续14d。在第14天下午3点，除正常组蒸馏水灌胃，溶媒对照组予相应体积0.5%DMSO灌胃外，其余各组均用1mg/kg衣霉素灌胃。
　　末次灌胃16h（禁食非限制饮水）后，摘眼球法取血，检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）及甘油三酯（triglyceride,TG）的含量；采用酶联接免疫吸附剂测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,Elisa)检测血清中葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein78,GRP78)的含量。剖取小鼠肝脏，计算肝脏指数；取肝左叶，制备10%肝匀浆，测定肝组织中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、还原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH)的含量。选取肝右叶，制备切片（5μm厚），采用苏木素-伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色，探察肝脏病理损伤。免疫组化法查看肝脏组织内GRP78的分布情况。末端脱氧核苷酸转移酶介导的三磷酸脱氧尿甘缺口标记法(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)观察小鼠凋亡肝细胞数。
　　结果：
　　1.高效液相法鉴定得出黄芩提取取物中有效成分黄芩苷的含量是31.2%。
　　2.相对正常鼠，酒精模型小鼠除肝内GSH活性降低外，肝指数、血清ALT、AST及TG，肝组织MDA数值均增大显著(P<0.01)。
　　3.与正常组比较，酒精模型组小鼠肝细胞脂肪空泡，将细胞核挤压至一边，伴有不同程度地中性粒细胞浸润，并可见点、碎片状坏死。
　　4.通过 Elisa法和免疫组化技术测定GRP78在小鼠血清和肝脏中的浓度和分布：相对正常对照组，酒精模型组小鼠血清中的GRP78的含量明显升高（P<0.01），肝组织内出现明显的GRP78黄棕色特染。
　　5.采用TUNEL技术观察小鼠肝细胞凋亡：与正常组相比，酒精模型组小鼠肝细胞凋亡数目明显增多。
　　6.在酒精诱导的急性肝损伤小鼠和衣霉素诱导的内质网应激小鼠中均可发现黄芩提取物能显著减低两个模型组中肝功能和血脂水平，修复病理损伤，降低血清和肝脏GRP78水平。抑制肝MDA浓度增加和GSH活性降低，减少凋亡肝细胞数目。
　　结论：
　　1.ERS参与小鼠急性酒精性肝损伤过程。
　　2.黄芩提取物对急性酒精性肝损伤小鼠有一定的保护作用。
　　3.SRE的护肝作用可能与抗氧化性和抑制ERS介导的肝细胞凋亡有关。

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中文摘要

英文摘要

前言

材 料 与 方 法

1.实验材料

2.实验方法

3. 统计学处理

结果

1.黄芩提取物中黄芩苷的含量测定

2.ERS在酒精诱导的小鼠急性肝损伤中的作用

3.酒精诱导的急性肝损伤小鼠肝细胞凋亡情况

4.黄芩提取物对酒精诱导的急性肝损伤小鼠的保肝作用

5. 黄芩提取物的保肝作用与内质网应激参与机制

6. 黄芩提取物对TM诱导的内质网应激小鼠的护肝作用及内质网应激参与机制

讨论

1. 急性酒精性肝损伤小鼠模型的建立

2. ERS在酒精介导的急性肝损伤小鼠中的作用

3. 黄芩提取物对酒精介导的急性肝损伤小鼠的护肝作用及ERS参与机制

4. 黄芩提取物对TM诱导的ERS小鼠的保肝作用及ERS参与机制

结论

参考文献

致谢

附 录A中英文缩略词对照表 （Abbreviation）

附 录B主要试剂溶液配制

附录 C个人简历

附录 D综述： 肝损伤动物模型研究进展