Cu对β-淀粉样蛋白神经毒性及聚集状态影响的体外实验研究

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种严重危害人类健康的神经退行性疾患，是老年性痴呆最常见的形式之一。AD的患病风险随着年龄增长而急剧上升，目前尚未找到行之有效的治疗方法。大量证据表明，β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)在AD患者脑内的大量产生、聚集以及沉积而形成老年斑(Senile plaque，SP)，在AD的发生、发展过程中起了关键性作用。Aβ是β-淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein，APP)的酶解产物，通常由39～42个氨基酸组成，以Aβ<,1-40>和Aβ<,1-42>最为常见。 老年斑中存在异常高浓度的Cu<'2+>，提示Cu<'2+>可能参与了AD的发病过程。Cu2<'2+>与Aβ结合后可能引发两种异常后果：发生氧化还原反应生成H<,2>O<,2>引起神经元的大量凋亡及促进Aβ沉积的形成。研究表明氧化应激在AD的发病过程中有重要作用，AD脑组织内发生大面积的脂质过氧化损伤、脑内积聚大量DNA、蛋白质的氧化产物。本文在细胞培养中将抗氧化剂VC、VE与Aβ或Aβ/Cu<'2+>络合物共同作用于神经元，结果表明VC、VE均能显著减轻AB的细胞毒性，但不能完全清除，提示Aβ引发的损伤可能存在除氧化应激外的其它机制。 目前关于Cu<'2+>与Aβ存在相关性的证据很多，但精确的共价结合几何学及参与Cu<'2+>结合的氨基酸位点仍然存在争议。本文实验结果提示His6、．His13、His14位点是Aβ上的Cu<'2+>结合位点，Tyr10的酚羟基是否为Aβ与Cu<'2+>结合提供O原子仍不清楚。细胞学实验提示Met35是Aβ神经毒作用的关键位点，但Ap与Cu<'2+>的结合过程不涉及Met35。 本文通过圆二色光谱、荧光光谱及光密度实验分析加入Cu<'2+>后对Aβ的结构与聚集状态的影响，结果提示无论是否加入Cu<'2+>，野生型Aβ结构中β-沉积含量均较低，可溶性Aβ寡聚物可能进一步聚合形成无定形沉积。综上，Aβ纤维状沉积与Aβ引发的氧化损伤及神经毒性呈负相关性，可溶性Aβ寡聚物可能是造成AD脑组织中大量神经细胞凋亡的源头。

目录

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缩略词表

摘要

一前言

(一)阿尔茨海默病的研究现状

1 AD的流行病学统计

2 AD的病理学特征

3 AD的发生

(二)β-淀粉样蛋白与AD

1 Aβ的产生

2 Aβ的细胞毒性

3 Cu2+与β-淀粉样蛋白

4与Aβ相关的AD治疗策略

(三)本实验的研究内容、目的及意义

1研究内容

2本实验的目的与意义

二材料与方法

(一)实验材料

1动物来源

2试剂及仪器

(二)实验方法

1神经元原代培养方法

2多肽制备及分组

3 MTT比色微量分析

4 H2O2含量检测

5乳酸脱氢酶检测

6 Aβ多肽的二级结构与沉积状态

7数据处理

三结果与分析

(一)皮层神经元的形态学观察

1神经元免疫细胞化学染色

2损伤Ⅰ、Ⅱ组神经元形态学观察

3 VC、VE保护组神经元形态学观察

(二)细胞存活率比较

1野生型及突变型Aβ对细胞存活率的影响比较

2 VC对野生型Aβ1-40细胞毒性的保护作用

3 VE对野生型Aβ1-40细胞毒性的保护作用

4加入VC、VE的保护组细胞存活率的比较

(三)H2O2释放量检测

1野生型及突变型Aβ释放H2O2量的比较

2 VC对H2O2释放量的影响

3 VE对H2O2释放量的影响

4加入VC、VE对H2O2释放量的影响比较

(四)乳酸脱氢酶(LDH)检测

1加入野生型及突变型Aβ后上清液中LDH活力比较

2 VC对细胞上清液中LDH活力的影响

3 VE对细胞上清液中LDH活力的影响

4加入VC、VE对上清液中LDH活力的影响比较

(五)圆二色光谱分析

1孵育与否对Aβ肽二级结构的影响

2 Cu2+浓度对野生型Aβ1-40二级结构的影响

3 Cu2+浓度对各种突变型Aβ二级结构的影响

(六)荧光光谱分析

1野生型Aβ1-40及其Cu2+络合物的荧光光谱

2各种突变型Aβ及其Cu2+络合物的荧光光谱

(七)紫外光谱分析

四讨论

(一)Aβ的毒性机制

(二)Aβ与Cu2+的结合位点分析

(三)Aβ聚集状态与神经毒性的关系

五结论与展望

(一)结论

(二)展望

六参考文献

致谢

附录一：攻读硕士学位期间发表或待发表的论文目录

附录二：攻读硕士学位期间发表的论文(复印件)

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