产志贺毒素大肠杆菌毒素基因的敲除

摘要

为了深入研究Stx2e基因与STEC的毒力相关性，本研究选择从江苏地区临床分离的F18阳性的STEC，利用Red/ET同源重组技术对目的基因Stx2e进行敲除。根据GenBank发表的Stx2e A单位基因序列(M21534)以及Red重组系统试剂盒提供的FRT-PGK-gb2-neo-FRT序列设计了一对引物，引物两端分别为50 bp的Stx2e基因同源序列，中间为两端带有FRT位点的卡那霉素筛选基因片段。结果将pRedET诱导表达质粒电转化入了S451521感受态细胞中；携带pRedET质粒的菌株经30℃培养，10%的L-阿拉伯糖诱导Red/ET重组蛋白表达后，将扩增回收好的同源臂电转化入诱导后的感受态细胞中，在Red重组酶的作用下，外源DNA片段与染色体上对应区域发生了重组，基因Stx2e被置换，构建Stx2e基因缺失株。经过基因组PCR鉴定结果表明，重组片段成功与目的基因发生同源置换，获得了具有卡那霉素抗性的Stx2e基因缺失株。最后，在FLP重组酶的作用下将FRT位点间的卡那霉素抗性基因消除，达到了无痕敲除的目的。该研究还发现Stx2e基因在STEC基因组中并非单拷贝，为构建F18+STEC毒素基因缺失株奠定了基础，也为未来制成无毒性口服黏膜疫苗和预防仔猪水肿病的工作奠定了基础。