研发一种TaqMan等位基因鉴别试验鉴别PEDV野生型和疫苗株

摘要

目的：研发一种区分疫苗株和野生毒株的准确、快速和可操作的方法以改善和简化PEDV的检测。方法：从3株疫苗株(KPED-9，SM98P和DR13)，5株分离到的PEDV和减毒口服疫苗DR13株提取病毒RNA。使用QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒提取PEDV RNA。设计两对引物扩增纤突蛋白基因。设计2条带有不同荧光染料的TaqMan探针用于在同一个反应管中检测不同基因分型。第一条探针针对口服疫苗S基因的等位基因(VIC)，第二条针对野生型S基因的等位基因(NED)。反应时间、温度等条件如下：50℃ 2min用于UNG激活，95℃ 10min用于激活AmpliTaq Gold酶活性，然后进40个循环，50℃ 15s，60℃ 1min。使用无模板的水作为阴性对照，重复3次。结果：可以区分3种样品中不同的病毒：口服型疫苗只有VIC荧光，野生型病毒只有NED荧光，混合样品同时有VIC和NED荧光。结论：使用MGB探针的一步法RT-PCR能够容易地区分野生型和口服疫苗的等位基因。