禽博尔纳病毒分离鉴定及其恒温扩增检测分析

摘要

本研究利用哺乳动物细胞从腺胃扩张症(PDD)患病鹦鹉体内分离一种新的博尔纳病毒(BDV).将鹦鹉“琉璃363”和“色彩”腺胃病料接种猪睾丸(ST)细胞单层出现圆缩、脱落,RT-PCR检测禽博尔纳病毒(ABV)基质蛋白(M)基因出现预计大小351bp产物条带,产物克隆序列进化树分析显示为ABV5基因型.利用DNAStar和PrimerExplorer V5.0(网络版)软件设计获得ID1,6,19,30和37共5组M基因LAMP引物,进行RT-LAMP反应后三组引物呈现阳性显色反应,并具有特异电泳条带.以钙黄绿素为荧光指示剂,实时RT-LAMP分别在36min (ID30)、38min (ID37)和49min (ID19)出现扩增反应曲线,60min内扩增达到峰值；浊度测定时三者出现扩增曲线的时间分别为56min、58min和65min.临床及有关样品检测RT-LAMP与RT-PCR结果一致,腺胃呈ABV阳性,大肠、小肠、十二指肠、心、肝、脾、肺、肾、肌胃、腺胃、腺胃内容物、胰腺、素囊、脑、肌肉等病料中未检出；病毒ST细胞培养物RT-LAMP检测10-1～10-5为阳性,RT-PCR检测10-3以后为阴性.新城疫、禽流感、法氏囊病、白血病J亚群、脑脊髓炎等有关病毒未见阳性反应.研究结果对鹦鹉及其他家禽致死性PDD防制提供新的技术手段,为BDV公共卫生研究提供有益的参考.