白藜芦醇通过抑制Akt/mTOR/p70S6k-4EBP-1及激活p38-MAPK信号路径诱导急性T淋巴细胞白血病细胞凋亡及自噬

摘要

目的：白藜芦醇是一种富含于多种食物尤其红葡萄皮中的天然多酚类化合物,具有广泛的生物学活性,对多种实体肿瘤均具有抑制作用,因而临床可用于肿瘤的化学预防及治疗.儿童急性T-淋巴细胞白血病(T-ALL)约占儿童ALL的20％-30％,其糖皮质激素耐药率及临床复发率均较高.因此寻找有效的、毒副作用小的新的药物对提高儿童T-ALL治疗具有重要临床意义.本文探讨白藜芦醇对T-ALL的作用及其分子机制.方法：以T-ALL糖皮质激素(GC)耐药的细胞株CEM-C1-15,Jurkat,Molt-4和GC敏感细胞株CEM-C7-14为研究对象,MTT法测定白藜芦醇对上述细胞的生长抑制作用;用单丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverin,MDC)荧光染色检测自噬泡、透射电镜检测检测自噬体的形成,Annexin V/PI双染及流式细胞术检测细胞凋亡;Westem blot检测白藜芦醇作用后细胞周期调节蛋白(cyclin A,Cyclin D,p21,p27)变化,Bcl-2家族促凋亡蛋白(Bim、Bad、Bax)、抗凋亡蛋白(Bcl-2、Mcl-1)的变化及Caspase-3活化状态,自噬特异性标志蛋白LC3-Ⅱ及Beclin-1变化,以及Akt/mTOR/p70S6k-4EBP-1和p38-MAPK信号通路活化状态的改变.结果：(1)白黎芦醇显著抑制CEM-CL-15,Jurkat,Molt-4和CEM-C7-14细胞的增殖，呈时间及浓度依赖性，白藜芦醇对4株T-LL细胞增殖的抑制程度依次为Jurkat细胞>Molt-细胞>CEM-CL-15细胞>CEM-C7-14细胞;(2)白黎芦醇诱导T-ALL细胞阻滞于GO/G1期，并伴有细胞周期调节蛋白周期素A(Cyclin A)及周期素D1(cyclin D1)的表达下调，而周期素依赖的激酶抑制剂p21及p27表达则显著上调;(3)白藜芦醇通过上调促凋亡蛋白Bax,Bim,Bad表达，下调抗凋亡蛋白Mcl-1，Bc1-2的表达诱导细胞凋亡以及活化Caspase-3诱导T-ALL细胞凋亡;同时通过上调自噬相关蛋白LC3-"及Beclin1的表达而诱导T-ALL细胞自噬;(4)白黎芦醇诱导T-LL细胞凋亡及自噬的过程伴有显著受抑的Akt/mTOR/p70S6k-4EBP-1信号路径(磷酸化Akt、磷酸化mTOR,磷酸化p70S6k、及磷酸化4EBP-，均显著下调)，同时有p38-MAPK信号路径的激活(磷酸化p38表达上调);(5)采用p38特异性抑制剂SB203580可部分抑制白藜芦醇诱导的T-ALL细胞凋亡和自噬，表现为:①抑制p38-MAPK的活化也抑制了白葵芦醇诱导的T-ALL细胞抗凋亡蛋白(Mcl-1,Bcl-2)表达的下调，并轻度抑制了Caspase-3的活化，但对促凋亡蛋白表达的影响不明显;②抑制p38-MAPK的活化也同时轻度下调了白藜芦醇诱导的T一LL细胞自噬相关蛋白Beclin-，及LC-31!的表达;(6)细胞自噬特异性抑制剂3-MA在抑制白藜芦醇诱导的T-LL细胞自噬的同时显著地增加了白藜芦醇诱导的T-ALL细胞的凋亡。结论：白藜芦醇可抑制T-ALL细胞增殖，诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡和自噬，其机制可能与抑制Akt/mTOR/p70S6K/4E-BP1信号通路和激活P38-MAPK信号通路有关;抑制自噬可增强白藜芦醇诱导的T-LL细胞凋亡，提示细胞自噬可能是白藜芦醇作用TT-LL细胞的一种自我保护机制。