靶向调控TBX53'UTR的miRNAs鉴定及其在先天性心脏病组织中的表达检测

摘要

目的：选取心脏发育中重要的核心转录因子-TBX5作为关注的效应基因,旨在鉴定与其3'UTR序列结合并调控TBX5表达的miRNAs,以及检测候选miRNAs在先天性心脏病(CHD)组织中的表达水平.方法：根据生物信息学的预测结果,选取TargetScan、Pictar、miRanda和DIANA等软件共同提示与TBX53'UTR结合的20个miRNAs进行荧光素酶报告基因实验;在获得候选miRNAs后,检测TBX53'UTR上其结合位点突变对于荧光素酶活性的影响,并通过qRT-PCR和Westem blot进一步证实候选miRNAs调控TBX5表达的机制,以及探讨miRNA-mRNA结合对于TBX5下游ANF转录的影响.同时,检测了28例CHD组织中候选miRNAs的表达水平.结果：通过细胞水平的荧光素酶筛选实验,发现miR-10a和miR-10b分别引起荧光素酶表达下调31.3％和30.2％(P＜0.05),而TBX53'UTR上其结合位点突变后,miR-10a和miR-10b转染组荧光素酶的表达量与对照组无显著差异.qRT-PCR和Western blot证实,miR-10a和miR-10b对HEK293T细胞内源TBX5 mRNA的表达无影响,但可引起其蛋白水平的显著下调;而miR-10a或miR-10b抑制剂则上调TBX5蛋白表达.同时,HEK 293T细胞共转染miR-10a和miR-10b均可显著抑制含ANF启动子区质粒的荧光素酶活性(分别下调29.5％和43.3％),而此现象在内源低表达TBX5的Hela细胞中不复存在.在CHD心脏组织中,miR-10a和miR-10b的mRNA表达量分别是对照组的2.77倍(P=0.008)和3.51倍(P=0.00045).结论：miR-10a和miR-10b能够通过直接靶向TBX53'UTR而在翻译水平抑制TBX5的表达和下游ANF的转录;同时,miR-10a和miR-10b在CHD心脏组织中的表达显著高于对照组.