猪肌生成抑制素基因敲除载体的构建

摘要

根据本研究组已完成的测定猪肌生成抑制素基因组序列和GenBank上提供的牛肌生成抑制素基因序列(6691bp),采用Oligo 6.0软件设计两对引物,以猪基因组DNA为模板,分别扩增长为4.3kb和1.4kb片段作为同源长短臂.在长臂扩增引物5'-端加上酶切位点及保护碱基,PCR产物纯化后进行核苷酸序列分析,并用Sal I和Xho I双酶切,得到含相应粘性末端的长臂片段;短臂克隆入pGEM<'(R)>-T载体,经过PCR、酶切鉴定,以及DNA核苷酸序列分析,证实所获得的片段正确后进行BamH I和Hind Ⅲ双酶切得到含相应粘性末端的短臂片段.再以先短臂后长臂的顺序插入到通用型基因敲除载体pSSC-9的正向筛选基因neo两侧多克隆位点,构建出猪肌生成抑制素基因置换型打靶载体pSSC-Larm-Sarm.酶切、PCR鉴定均表明成功构建了猪肌生成抑制素基因敲除载体.为下一步构建肌生成抑制素基因缺失成纤维细胞并以此细胞进行肌生成抑制素基因敲除猪的研究奠定了基础.