干预GDNF基因后间充质干细胞定向分化的实验研究

摘要

目的:分离、纯化及鉴定大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),干预大鼠骨髓间充质干细胞内源性胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因表达,并观察基因干预后细胞向神经样细胞分化特征.方法:全骨髓贴壁法分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),流式细胞技术鉴定细胞表型分子;获取第三代大鼠骨髓间充质干细胞后,实验分为A、B、C三组,A组以载鼠源性胶质细胞源性神经营养因子(rGDNF)与绿色荧光蛋白(GFP)基因重组腺病毒(Ad-rGDNF-GFP)感染BMSCs,B组以载GFP基因重组腺病毒(Ad-GFP)感染BMSCs,C组为非感染空白对照组.荧光显微镜观察三组中BMSCs表达GFP情况,荧光定量PCR (Q-PCR)比较各组GDNFmRNA在细胞内表达水平,MTT法测定三组中细胞活力,并分别在转染后5、10d后免疫荧光检测表达巢蛋白(Nestin)和微管蛋白-2(MAP-2)在BMSCs内的表达情况.结果:全骨髓贴壁法可获取贴壁细胞,连续半换液法可进一步分离、纯化该贴壁细胞,流式细胞技术鉴定结果表明该细胞为大鼠骨髓间充质干细胞,显微镜观察发现该细胞多为梭形,形态较为统一;荧光显微镜观察观察发现,Ad-rGDNF-GFP与Ad-GFP感染BMSCs 5d、10d后,均可观察到GFP的表达,空白对照组未见GFP表达;Q-PCR结果表明Ad-rGDNF-GFP感染组GDNF基因表达水平较Ad-GFP感染组与空白对照组显著提高,且Ad-rGDNF-GFP感染组中细胞活力亦高于其他两组;Ad-rGDNF-GFP感染BMSCs 5d后,免疫荧光鉴定结果证实细胞表达神经元干细胞标志物-巢蛋白,10d后,细胞表达成熟神经元标志物-微管蛋白-2(MAP-2),而Ad-GFP感染组与空白对照组细胞在相应检测时间定均未表达Nestin与MAP-2.结论:以全骨髓贴壁法为基础通过连续半换液法可分离、纯化骨髓间充质干细胞,Ad-rGDNF-GFP感染BMSCs后,细胞GDNF表达水平及细胞活力可显著提高,并在内源性GDNF作用下向神经样细胞定向分化.