新孢子虫GRA6和GRA11的克隆、表达和功能研究

摘要

本研究扩增获得GRA 11和GRA6,测序与结构分析发现,GRA 11基因全长2322bp,无内含子,分子量约为82.817kDa,共有碱性氨基酸121个,酸性氨基酸99个,存在信号肽和跨膜区；GRA6全长为582-bp,无内含子,分子量约为19kDa,存在信号肽和跨膜区.分别将GRA 11和GRA6插入原核表达载体pE-T28a和pGEX-6p-1,表达、纯化蛋白,经鉴定后,分别免疫BABL/c小鼠,获得两种蛋白的高滴度多抗血清.应用间接免疫荧光方法进行虫体内蛋白定位发现,GRA 11蛋白定位在纳虫空泡膜上,GRA6蛋白在整个虫体内均有分布.构建真核表达载体pcDNA3.1-GRA11和pcDNA3.1-GRA6,转染HEK293T细胞鉴定.分别用重组蛋白和真核表达质粒免疫小鼠,检测抗体水平；免疫后2周攻虫(106/只),应用Realtime PCR检测攻虫1个月后小鼠脑内荷虫量.与对照组相比,免疫小鼠产生高水平的特异性抗体,免疫后攻虫小鼠脑内荷虫量明显降低.说明该两种蛋白具有较好的免疫原性.