表达PRRSV GP5蛋白重组减毒猪霍乱沙门菌C78-1构建及生物学特性

摘要

为了构建表达猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒PRRSV GP5蛋白口服重组减毒猪霍乱沙门氏菌活载体疫苗株,通过PCR克隆去除信号肽序列的PRRSV ORF5基因,将其插入到表达载体pYA3493中,构建了重组质粒pYA3493－dORF5.将该重组质粒电转入猪霍乱沙门菌基因缺失株(缺失crp,asd基因),获得PRRSV ORF5基因减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔasdC78-1(pYA－dORF5)重组菌。通过对重组菌表型性状、生长特性、稳定性及安全性和定制能力进行测定,并对重组菌表达的GP5蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示,该菌株保留了在DAP阴性环境中生存的能力;不能利用麦芽糖、蔗糖及果糖等碳源,但保留了利用葡萄糖的能力,其生长速度低于强毒株C78-1,而与ΔcrpΔasdC78-1相比变化不明显;在体外连续传代能够稳定遗传dORF5目的基因片段。Western-blot证实重组菌表达的GP5蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合;通过口服途径与强毒株C78-1及猪霍乱沙门菌弱毒疫苗株C500相比,ΔcrpΔasdC78-1(pYA－dORF5)毒力分别下降492倍和1.3倍。通过侵袭力实验测得重组菌在血液,肠系膜淋巴结和脾脏均定植能力良好。结果表明,成功构建了能稳定表达PRRSV GP5蛋白的口服重组减毒猪霍乱沙门菌,为研究PRRSV口服基因工程疫苗奠定了良好的基础。