重组PRRSVORF5基因减毒猪霍乱沙门氏菌C78-1生物学及免疫学特性初步研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)引起的以妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍和仔猪严重的呼吸道症状及高死亡率为特征的传染病，并已成为危害全球养猪业最严重的传染病之一。沙门氏菌作为一种细胞内侵袭性寄生菌，能有效的呈递外源抗原，能同时激发机体产生抗沙门氏菌和诱导外源蛋白的细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫应答。本研究以携带 PRRSV ORF5基因的重组减毒猪霍乱沙门氏菌为研究对象，检测了其生物学特性和免疫学特性，为PRRS新型基因工程疫苗的研究和减毒猪霍乱沙门氏菌携带和表达外源基因的可行性提供了新的思路。
　　（1）实现了PRRSV ORF5的原核表达将PRRSV ORF5基因的N端的31个氨基酸的信号肽编码序列截去，构建了原核表达载体pET28a-dORF5并实现了高效表达，经SDS-PAGE和Western-blot检测表明，表达的PRRSV GP5重组蛋白具有良好的反应原性。进而将表达的 GP5蛋白经镍柱纯化并复性后，得到了纯化和复性的 GP5蛋白，为进一步研究 GP5蛋白的生物学功能奠定了良好的基础。
　　（2）重组PRRSV ORF5减毒猪霍乱沙门氏菌的生物学特性研究对重组菌的表型性状、生长特性、稳定性以及安全性等生物学特性进行检测，并对其表达的GP5蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示，该重组菌株恢复了在 DAP阴性环境中生存的能力；同时不能利用麦芽糖、果糖及蔗糖等碳源，但仍能够利用葡萄糖，其生长速度明显低于强毒株 C78-1，而与?crp?asdC78-1相比没有明显变化；在体外连续传代培养能够稳定遗传578 bp dORF5基因片段。Western-blot分析证实重组菌表达的 GP5蛋白能与 PRRSV阳性血清特异性结合；通过口服感染的途径，测得亲本株 C78-1的毒力是重组菌?crp?asdC78-1(pYA-dORF5)的492倍，而疫苗株C500的毒力是重组菌的1.31倍。
　　（3）重组PRRSV ORF5减毒猪霍乱沙门氏菌免疫学特性初步研究将重组菌接种小鼠，对其在小鼠体内的分布情况进行了检测。同时，分别应用 ELISA方法检测小鼠不同时期血清中抗PRRS GP5抗体、沙门氏菌抗体和肠液中SIgA抗体的产生情况以及 MTT法检测淋巴细胞分化情况，以了解重组菌的免疫学特性。结果显示，重组菌能够在小鼠体内稳定存活，具有良好的侵袭力。血清抗体IgG检测结果显示，在二次免疫后第1周，抗 GP5抗体达到高峰，OD值达到0.788，此时空白菌对照组和 PBS对照组的 OD值仅为0.022和0.0218；而对于沙门氏菌IgG抗体来说，重组菌株与疫苗株C500的免疫力相当。二免后4周小鼠肠粘膜液中分泌性 SIgA抗体的量显著高于两个对照组，分别为10.58、0.55和2.73；淋巴细胞转化实验表明该重组能够刺激小鼠产生较强的细胞免疫应答反应，说明该重组菌能诱导小鼠产生较强的抗体水平和激发多种免疫应答方式。

目录

符号表

第1章 文献综述

1.1猪繁殖与呼吸综合征研究进展

1.1.1猪繁殖与呼吸综合征及其危害

1.1.2猪繁殖与呼吸综合征的病原学

1.1.3 GP5 蛋白

1.1.4猪繁殖与呼吸综合征的流行病学

1.1.5猪繁殖与呼吸综合征的临床症状

1.1.6猪繁殖与呼吸综合征的病理学

1.1.7猪繁殖与呼吸综合征的致病机理

1.1.8猪繁殖与呼吸综合征的诊断

1.1.9猪繁殖与呼吸综合征的防制

1.1.10猪繁殖与呼吸综合征的疫苗

1.2猪霍乱沙门氏菌防治及载体研究进展

1.2.1猪霍乱沙门氏病及防治

1.2.2减毒沙门氏菌载体研究进展

第2章PRRSV ORF5基因原核表达载体的构建及优化表达

2.1材料

2.1.1菌株与质粒

2.1.2实验所用的主要试剂及酶

2.1.3主要培养基及试剂的配制

2.1.4主要实验仪器

2.1.5本研究中所用到的引物

2.2方法

2.2.1菌种复苏

2.2.2小量质粒的提取

2.2.3目的基因片段的酶切

2.2.4目的基因产物的回收和纯化

2.2.5目的基因产物与pET28a载体的连接

2.2.6感受态细胞的制备

2.2.7重组质粒转化感受态细胞

2.2.8重组菌的鉴定

2.2.9外源基因在重组菌中的诱导表达

2.2.10不同诱导条件对目的蛋白表达量的影响

2.2.11目的蛋白的SDS-PAGE电泳

2.2.12包涵体的提取和纯化及浓度测定

2.2.13包涵体的复性

2.2.14表达产物的特异性检测

2.3结果与分析

2.3.1原核表达载体pET28a-dORF5的鉴定

2.3.2重组GP5蛋白的诱导表达

2.3.3IPTG浓度对PRRSV GP5蛋白表达含量的影响

2.3.4诱导时间对重组GP5蛋白表达量的影响

2.3.5 GP5蛋白的纯化及复性

2.3.6重组GP5蛋白的Western blot鉴定

2.4讨论

第3章重组PRRSV ORF5基因减毒猪霍乱沙门氏菌C78-1生物学特性研究

3.1材料

3.1.1菌株、试剂

3.1.2实验动物

3.1.3主要试剂的配制

3.1.4主要实验器材

3.2方法

3.2.5重组菌株ΔcrpΔasd C78-1(pYA-dORF5)对小鼠的安全性试验

3.3结果与分析

3.3.1重组菌株ΔcrpΔasd C78-1(pYA-dORF5)表型性状及生化特性

3.3.2重组菌株ΔcrpΔasdC78-1(pYA-dORF5)生长特性

3.3.3 dORF5基因在ΔcrpΔasd C78-1(pYA-dORF5)中的稳定性鉴定

3.3.4重组菌株ΔcrpΔasd C78-1(pYA-dORF5)的分泌表达

3.3.5重组菌株ΔcrpΔasd C78-1(pYA-dORF5)的毒力实验测定结果

3.4讨论

第4章重组PRRSV ORF5基因减毒猪霍乱沙门氏菌C78-1对小鼠免疫学特性研究

4.1材料

4.1.1菌株和试剂

4.1.2主要试剂的配置

4.1.3实验动物

4.1.4主要实验器材

4.2方法

4.2.1实验小鼠口服重组菌株后在体内的分布及定植情况

4.2.2 ELISA抗原的制备

4.2.3间接检测小鼠血清抗体的ELISA法的步骤

4.2.4抗原最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定

4.2.6免疫小鼠的血清IgG抗体的检测

4.2.7免疫小鼠的淋巴细胞转化实验

4.2.8黏膜免疫ELISA试剂盒检测小鼠肠粘膜SIgA抗体

4.2.9统计学分析

4.3结果与分析

4.3.1重组菌株ΔcrpΔasdC78-1(pYA-dORF5)口服后在小鼠体内的分布

4.3.2抗原最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定结果

4.3.3间接ELISA检测免疫小鼠血清IgG抗体

4.3.4免疫小鼠淋巴细胞转化实验

4.3.5肠道分泌性总SIgA抗体检测结果

4.4讨论

第5章 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果