穿膜肽TAT的原核表达及其穿膜效果的初步研究

摘要

为了进一步建立蛋白诱导水牛iPS细胞体系,本试验对穿膜肽TAT与标记蛋白EGFp进行了融合表达,同时引入核定位NLS序列,获得纯化蛋白后进行细胞共培养试验,以探讨穿膜肽TAT对携带水牛干细胞转录因子纯化蛋白进入细胞内的效果.首先通过PCR扩增、TA克隆、双酶切以及T4连接等步骤构建原核表达载体pET-EGFp和pET-NLS-EGFP-TAT;再将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,用SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达;然后用HisTrapHp层析柱纯化融合蛋白,经复性、透析和浓缩后,最后将纯化的EGFp蛋白和NLS-EGFP-TAT蛋白分别添加到水牛成纤维细胞中共培养.结果表明,成功表达了融合蛋白EGFP(47.3kDa)和NLS-EGFP-TAT(50.1kDa);纯化蛋白与水牛成纤维细胞共培养5-8h后,EGFp蛋白不能进入细胞内,而NLS-EGFP-TAT蛋白在穿膜肽TAT的帮助下能够顺利进入细胞内,但未能显著定位到细胞核内.